Enrichissement sélectif et isolement des bactéries marines dégradant le pétrole à partir d’échantillons d’eau de mer

Résumé

Source : Villela, H. D. M. , et al. Prospection de souches microbiennes pour la bioremédiation et le développement de probiotiques pour la recherche et la préservation des métaorganismes. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’isolement sélectif des bactéries marines dégradant le pétrole en enrichissant des échantillons d’eau de mer sur des milieux pétroliers, permettant la récupération de souches pures susceptibles d’être utilisées dans la bioremédiation du pétrole brut et le nettoyage environnemental.

Protocole

1. Collecte et stockage de l’eau et des coraux pour l’isolement microbien

NOTE: Il est essentiel de prendre les coordonnées et la température des sites d’échantillonnage. Si possible, des métadonnées telles que la salinité, le pH, la profondeur et l’intensité lumineuse peuvent également aider à trouver des approches de culture affinées et à interpréter les données à l’avenir. Pour des résultats fiables, conservez les échantillons le moins longtemps possible. Les microbiomes de l’eau/coraux peuvent changer considérablement si les échantillons ne sont pas conservés à la bonne température et/ou conservés pendant de longues périodes. Si l’étape d’isolation n’est pas effectuée immédiatement après la collecte, il est crucial de maintenir les échantillons à 4 °C jusqu’au traitement. Plus les échantillons sont stockés longtemps, même à 4 °C, plus la communauté microbienne évolue.

1. Échantillonner et stocker l’eau de mer.
   1. Prélever 500 mL d’échantillons d’eau au moins triplicés à partir de chaque site ciblé. De préférence, utilisez des bouteilles stériles avec des bouchons à vis.
   2. Si vous traitez l’eau immédiatement après la collecte, gardez les bouteilles à température ambiante (RT) pendant un court intervalle. Si le traitement de l’échantillon a lieu plus tard, gardez les bouteilles à 4 °C.
2. Échantillonner et stocker le corail.
   1. Utilisez une pince stérile pour couper des fragments de corail sur le même site d’échantillonnage que les échantillons d’eau. Pour éviter toute contamination, ne touchez les coraux qu’avec des gants stériles.
   2. Rincez le fragment de corail échantillonné à l’aide d’une solution saline stérile de 20 mL (3 % de NaCl (chlorure de sodium) dans l’eau distillée) ou de l’eau de mer artificielle pour éliminer les bactéries libres faiblement attachées de l’eau de mer.
   3. À l’aide de pinces, placez chaque fragment de corail dans un récipient stérile de 250−500 mL avec un bouchon à vis contenant une solution saline stérile.
   4. En laboratoire, à l’aide de pinces et de pinces stériles, pèser 5 g de fragments de corail à l’aide de boîtes de Petri stériles de 100 mm x 20 mm sur une balance.
   5. Transférez les 5 g d’échantillon de corail dans un mortier stérile et macérez-le à l’aide d’un pilon stérile.
   6. À l’aide d’une spatule stérile, transférez l’échantillon macéré dans une fiole de culture stérile contenant 45 mL de solution stérile de NaCl à 3 % et 10−15 billes de verre de 5 mm. Utilisez un peu de solution saline stérile de 45 mL pour laver le mortier et récupérer la quantité maximale de macérate.
   7. Maintenez les fioles sous agitation constante (150 x g) pendant 16 heures à la température de l’eau du site d’échantillonnage.
      NOTE: Pour les coraux d’eaux peu profondes, la température optimale varie entre 24 et 28 °C. Cette étape détachera les micro-organismes de différents compartiments coralliens, comme ceux attachés aux cellules hôtes, ou ceux vivant à l’intérieur du tissu et du squelette. Après cette étape, les macérats de corail ne doivent pas être stockés, et l’étape d’isolement doit être effectuée instantanément.

2. Isolement des bactéries dégradant le pétrole de l’eau de mer et/ou des coraux

1. Préparez un milieu minimum contenant une fraction hydrosoluble en huile (oWSF) et une fraction insoluble en eau huileuse (oWIF) comme seule source de carbone.
   1. Ajoutez 1−2 % de pétrole brut à 500 mL d’eau distillée stérile. Utilisez une fiole filtrante ouverte au fond pour retirer la fraction soluble sans perturber la couche supérieure de la fraction insoluble.
   2. Maintenez le mélange sous agitation constante à 24−28 °C à 150 x g pendant 48 heures.
   3. Placez la fiole filtrante contenant les fractions de pétrole brut sur une surface stable et attendez 10 à 20 minutes pour permettre la séparation des fractions solubles et insolubles.
   4. Transférez l’oWSF dans une nouvelle fiole stérile, en économisant l’oWIF en ouvrant la fiole filtrante inférieure et en retirant la fraction soluble.
   5. En utilisant tout l’oWSF récupéré à l’étape précédente (~400 mL), préparez 1 L de milieu BH (Bushnell Haas) contenant un minimum d’agar contenant oWSF comme seule source de carbone.
   6. En utilisant l’oWIF restant dans la fiole de l’étape 2.1.4, préparez 1 L de milieu agar minimum BH contenant l’oWIF comme seule source de carbone.
2. Isoler les bactéries dégradant les oWSF et oWIF.
   1. En utilisant de l’eau et du macérat corallien des étapes 1.1.2 et 1.2.7 respectivement, diluez les échantillons jusqu’à ^10-6 dans une solution saline stérile comme ci-dessous.
3. Effectuer des dilutions en série jusqu’à ^10-9 dans une solution saline stérile pour les échantillons de coraux et jusqu’à ^10-6 pour les échantillons d’eau. La pipette dilue 5 fois avant de jeter la pointe. Vortex échantillonne pendant 5 s à chaque fois avant d’effectuer la prochaine dilution sérielle.
4. Pipeter 100 μL de chaque dilution sur des boîtes de Petri contenant des milieux agar BH-oWSF et BH-oWIF et les assisser.
5. Incubez les plaques pendant 1 à 3 jours à la température cible (par exemple, 26 °C). Vérifiez les plaques une fois par jour.
6. Sélectionnez et isolez les colonies présentant des morphologies de croissance distinctes sur de nouvelles plaques en utilisant la technique de la plaque striée. Répétez cette étape autant de fois que nécessaire pour que des colonies pures poussent sur les plaques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouteille de stockage de médias PYREX de 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1743E20/1395-500	Utilisé pour échantillonner de l’eau.
Bouteilles aspiratrices de 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Utilisé pour séparer les fractions d’huile.
Pince coupe-fil de 6 pouces	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Utilisé pour couper des fragments de corail.
Agar-agar	Himedia	PCT0901-1KG	On faisait des supports solides.
Bouillon Bushnell Haas	Himedia	M350-500G	Utilisé comme média minimal à compléter par des sources de carbone.
Erlenmeyer	Thomas Scientific/DWK Sciences de la Vie (Kimble)	4882H35/26500-125	Utilisé pour incuber le macérat corallien avec des perles de verre.
Hotte à écoulement laminaire			Il fallait travailler dans des conditions stériles.
Luria Bertani Broth, Meunier (Moulin Luria Bertani Broth)	Himedia	M1245-1KG	Utilisé comme milieu riche pour cultiver des bactéries.
Agar marin 2216 (agar marin Zobell)	Himedia	M384-500G	Utilisé comme milieu riche pour cultiver des bactéries.
Incubateur à shaker orbital			Utilisé pour incuber des milieux liquides et de l’huile.
Incubateur d’assiettes			Utilisé pour incuber des plaques.
Mortier et pilon en porcelaine	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Utilisé pour macérer des fragments de corail.
Centrifugeuse réfrigérée			Utilisé pour centrifuger des cultures bactériennes.
Spectrophotomètre			Utilisé pour mesurer la densité optique des cultures bactériennes.
Kit de purification génomique de l’ADN Wizard	Promega	A1120	Utilisé pour l’extraction d’ADN de souches microbiennes.