Suivi de la croissance bactérienne à une seule résolution cellulaire dans un système microfluidique

Résumé

Source : Cabeen, M. T., et al. Analyse microfluidique monocellulaire de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo montre l’utilisation d’un dispositif microfluidique pour observer la croissance bactérienne au niveau de la cellule unique. Il montre comment les cellules bactériennes non mobiles, confinées dans des tranchées à l’échelle microscopique, sont continuellement nourries et imagées au microscope à fluorescence. Cette configuration permet la visualisation en temps réel de la division cellulaire et du suivi de la lignée sur plusieurs générations.

Protocole

1. Diffusion de dispositifs PDMS

1. Dans un environnement sans poussière, mélangez le polymère polydiméthylsiloxane (PDMS) et l’agent de durcissement à un ratio de 10:1 et dégazez sous vide pendant au moins 10 minutes.
2. Placez un maître en silicium (ou une réplique en époxy ou en polyuréthane) sur un morceau de feuille d’aluminium non cassée dans une plaque de Petri en polystyrène. Versez le mélange PDMS dégazé sur le maître jusqu’à une profondeur d’environ 5 mm. Dégazez la plaque de Petri pendant au moins 10 minutes. Utilisez un jet d’air doux pour briser les bulles de surface.
   NOTE: Une réplique maîtresse en plastique peut partiellement flotter lors du dégazage ; Si cela se produit, appuyez sur la réplique avec un applicateur en plastique propre.
3. Faites durcir le PDMS pendant au moins 1 heure dans un four à 60 °C et laissez-le refroidir à température ambiante. Retirez le papier aluminium contenant le maître et le PDMS durci de la plaque de Petri. Décollez soigneusement le papier aluminium à l’arrière du master, puis décollez délicatement le PDMS du master.
   NOTE: Sinon, le PDMS peut être guéri pendant la nuit à température ambiante. La fragilité relative d’un maître en plaquette en silicium peut être surmontée en utilisant de l’adhésif époxy pour fixer définitivement la plaquette à un disque en aluminium de 1/16 de pouce d’épaisseur de la même taille que la plaquette.
4. Comme une plaquette comprend généralement plusieurs dispositifs microfluidiques de dimensions légèrement différentes, il faut découper un seul appareil à la taille à l’aide d’un scalpel propre et tranchant.
   NOTE: Pour le travail de routine avec Bacillus subtilis , utilisez des dispositifs avec des tranchées cellulaires de 1,0 μm de large.

2. Perforation et liaison du dispositif

1. Placez un morceau de ruban adhésif translucide de bureau (voir Tableau des matériaux) sur le côté à motifs de l’appareil pour améliorer la visibilité des caractéristiques à motifs. Les orifices d’entrée et de sortie sont identifiés comme des zones circulaires aux extrémités opposées des canaux fluidiques visibles (Figure 1). Pour améliorer leur visibilité lors des trous dans l’appareil pour les broches d’entrée et de sortie, marquez les entrées et sorties avec des points à l’aide d’un marqueur à pointe fine.
   NOTE: Pour s’assurer que les broches d’entrée et de sortie ne sont pas encombrées, chaque autre canal est perforé, en commençant par le canal juste en dessous du désignateur alphabétique de l’appareil.
2. Retournez le dispositif PDMS de façon à ce que le côté à motif soit vers le bas, puis percez l’appareil jusqu’aux points marqués à l’aide d’une perforation de biopsie de 0,75 mm ; Jetez les perforations.
   NOTE: Les dispositifs sont perforés avec le côté à motifs vers le bas car le trou généré par la perforatrice de biopsie est généralement légèrement évasé à l’endroit où le punch entre dans le polymère. En posant le dispositif dans une orientation inversée, le trou du côté à motifs a une bordure nette.
3. À l’aide d’un stéréomicroscope, assurez-vous que les trous perforés chevauchent les zones d’entrée et de sortie de l’appareil. Utilisez une pince à pinces à pointe fine pour retirer tout fragment superflu de PDMS provenant des trous perforés.
4. Utilisez du ruban adhésif pour enlever la poussière des deux côtés de l’appareil et placez-le dans une plaque de Pétri en polystyrène propre. Préparez un verre de couverture de 22 mm x 40 mm en l’humidifiant avec de l’alcool isopropylique à 100 % et en frottant avec une lingette de chambre blanche ; sécher avec un jet d’air ou d’azote sans poussière.
5. Placez le dispositif PDMS perforé face visible avec le verre de couverture nettoyé dans un nettoyant plasma à oxygène.
   1. Traiter l’appareil par plasma avec les réglages suivants : vide, 70 mTorr ; Pression O₂, 200 mTorr ; durée, 15 s ; puissance, 30 W. Immédiatement après la fin de la période de traitement au plasma, retirez l’appareil et couvrez le verre du nettoyant plasma.
   2. Inversez le PDMS et placez-le au centre du verre de couverture de sorte que le côté à motifs touche le verre ; Assurez-vous que les canaux d’alimentation (passant entre les zones d’entrée et de sortie) sont alignés avec l’axe long du verre de couverture. Appuyez très doucement pour s’assurer que le PDMS s’étanche contre le verre.
6. Faites cuire l’appareil assemblé au four pendant au moins 1 h à 60 °C. Après la cuisson, vérifiez manuellement que le PDMS est fixé au verre en appuyant doucement sur un coin de l’appareil.
   NOTE: Une fois le dispositif lié, il doit être utilisé dans les 24 heures, car le polymère deviendra de plus en plus hydrophobe avec le temps suivant le traitement au plasma.

3. Préparation de la plomberie microfluidique

1. Taillez les longueurs de tube polymère (diamètre intérieur (DI) 0,02 pouce, diamètre extérieur (OD) 0,06 pouce) selon les longueurs appropriées pour aller de la pompe à seringue à l’appareil de commutation (si utilisé) et à l’appareil lorsqu’il est monté sur le microscope. Coupez autant de longueurs qu’il y a de voies microfluidiques.
2. Assemblez les jonctions en Y pour les vannes de pincement (si utilisées) en coupant et en fixant des longueurs de 2 cm de tube flexible en silicone (0,03 pouce de diamètre intérieur, 0,065 pouce de diamètre extérieur) aux barbillons supérieurs du « Y » et des longueurs de tubage en silicone de 1 cm à la barge inférieure du « Y ».
3. Découpez des longueurs de 10 cm (ou appropriées) de tubulure polymère ; les relier à une extrémité à la jonction de commutateur en les insérant dans les segments de tube en silicone de 1 cm sur la barbe inférieure du « Y ». Reliez-les à l’autre extrémité à des aiguilles de 21G qui ont été retirées de leurs adaptateurs en plastique et pliées d’environ 90° à environ 9 mm de l’extrémité de l’aiguille.
4. Connectez des aiguilles émoussées de 21 G à une extrémité des segments de tube qui iront des seringues à l’appareil d’interrupteur en insérant les aiguilles dans le tube. Insérez les autres extrémités de chaque longueur de tube dans les segments de tubulure en silicone sur les barbes d’entrée des jonctions en Y.
   NOTE: Utilisez un appareil pour maintenir les vannes de pincement et les jonctions en place ; cela peut facilement être fabriqué à partir d’une boîte à embout de micropipette (Figure 2D).
5. Coupez des longueurs de tube polymère pour transporter les déchets de la sortie de l’appareil vers un bécher à déchets. Reliez-les à une extrémité à des aiguilles de 21 G pliées préparées comme décrit ci-dessus. Attachez l’autre extrémité des tubes dans un bécher à déchets.
6. Préparez les volumes appropriés de milieux contenant 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et remplissez la taille et le nombre de seringues souhaités. Connectez les seringues chargées de BSA aux aiguilles préparées de 21G fixées au tube d’admission et chargez les seringues dans des pompes à seringues.
   NOTE: Pour les expériences typiques, 5 canaux du dispositif sont utilisés, chacun équipé d’une seringue de 20 mL. Une expérience dans laquelle le milieu est changé nécessitera 2 banques de 5 seringues chacune. Ici, la pompe contenant la première banque est appelée pompe de phase 1, et la pompe contenant la seconde banque, avec le milieu post-commutation, est appelée pompe de phase 2.
7. Évacuez l’air de la canalisation d’entrée en faisant fonctionner les pompes à seringues à un débit élevé (>500 μL/min), en commençant par orienter les pompes à seringue verticalement et en tapotant les seringues pour faire monter les bulles d’air en surface. Une fois l’air purgé des seringues, placez la pompe à seringue horizontalement et faites progressivement remonter ou faire remonter progressivement les lignes polymères des seringues à travers l’appareil d’interrupteur pour déloger et purger les bulles d’air. Répétez ce processus pour la deuxième banque de seringues (si vous changez de support).
8. Après la purge des bulles d’air, réglez la pompe à seringue de phase 2 (c’est-à-dire avec le milieu utilisé en second, après l’interrupteur) à 1,5 μL/min, puis mettez le débit en pause. Placez de petites pinces de liant sur les segments de tuyau flexible sur la branche des jonctions en Y correspondant à la deuxième phase de médium. Continuez à faire fonctionner la pompe à seringue de phase 1 à un débit modéré (par exemple, 10 μL/min) pendant au moins 30 minutes pour purger le second milieu du tuyau d’entrée en aval de la jonction en Y.

4. Préparation en culture cellulaire

1. Cultivez une préculture de la souche d’intérêt pour le milieu désiré du jour au lendemain, jusqu’à la phase stationnaire. La souche bactérienne doit contenir une mutation qui immobilise les cellules, afin qu’elles ne sortent pas des canaux de l’appareil.
   NOTE: Dans ce protocole, la souche bactérienne est B. subtilis 3610 contenant une substitution A233V par la sorcière(cette mutation rend le flagelle droit plutôt que hélicoïdal, empêchant la motilité cellulaire), un rapporteur PrsbV-mNeonGreen pour le stress cellulaire, et un rapporteur constitutif Phyperspank-mNeptune (rouge) pour mettre en évidence les cellules. Le milieu Lennox de Luria-Bertani (LB) est utilisé dans le protocole d’exemple. Les souches typiques pour les expériences de microfluidique contiennent un ou plusieurs rapporteurs transcriptionnels fluorescents et une protéine fluorescente cytoplasmique produite de manière constitutive pour faciliter la détection automatisée des cellules. Aucun défaut de croissance n’a été observé lors de l’utilisation d’un milieu riche en LB Lennox, mais la croissance de B. subtilis dans un milieu minimal peut être inhibée dans des conditions microfluidiques car les siderophores sécrétés sont emportés par le flux du milieu. Dans de telles circonstances, la croissance peut être restaurée par l’ajout de citrate de sodium et de chlorure ferrique au milieu, comme indiqué pour le milieu S750.
2. Le matin de l’expérience, diluez les cellules de B. subtilis à 1:50 dans une fiole déflectrice de 250 mL contenant 25 mL de milieu de croissance. Faites croître les cellules pendant 5 à 6 heures en culture secouée à 37 °C jusqu’à une densité optique supérieure à 1.
   NOTE: Une culture cellulaire dense est préférable car les cellules de B. subtilis en phase stationnaire sont plus petites et moins fréquentes dans les chaînes cellulaires, facilitant ainsi la charge des dispositifs. Différentes espèces bactériennes peuvent nécessiter d’autres milieux ou conditions de croissance pour une charge optimale.
3. À l’aide d’une seringue équipée d’un filtre de la taille d’un pore de 5 μm, filtrez environ 15 mL de culture cellulaire dans un tube conique de 15 mL pour retirer les chaînes cellulaires de B. subtilis (ce n’est pas nécessaire pour E. coli et peut ne pas être nécessaire pour d’autres espèces).
   NOTE: Relativement peu de cellules doivent être retirées ; Le filtrat doit être trouble.
4. Centrifugez la culture filtrée pendant 10 minutes à 4 000 x g à température ambiante. Versez le surnageant et remettez la pellete en suspension dans le liquide surnageant résiduel restant dans le tube, en ajoutant environ 500 μL de milieu frais si nécessaire pour faciliter la pipetage de la suspension cellulaire.

5. Chargement des appareils

1. Placez doucement des pointes fines de micropipette vides à chargement en gel (voir Tableau des matériaux) dans les trous de sortie du dispositif microfluidique.
2. À l’aide de fines pointes à chargement gelé avec une micropipette P200, passivez l’appareil en injectant un milieu contenant 1 mg/mL de BSA dans les trous d’entrée, en observant les extrémités dans les trous de sortie pour surveiller le remplissage des canaux microfluidiques (Figure 2A). Faites couver l’appareil à température ambiante pendant environ 5 minutes.
   NOTE: La BSA est couramment utilisée comme agent bloqueant ou passivateur qui se lie à la surface hydrophobe du polymère PDMS, augmentant ainsi son hydrophilicitie et réduisant la liaison d’autres protéines ou des cellules (via les molécules de surface cellulaire).
3. À l’aide de fins pointes à chargement gel, chargez chaque canal avec les cellules en suspension (de la Section 4), en utilisant les pointes du canal de sortie pour surveiller l’évolution des cellules dans l’appareil (Figure 2B).
   NOTE: La charge est facilitée en réglant la micropipette P200 à son volume maximal de 200 μL, puis en aspirant un coussin d’air avant d’aspirer un petit volume (environ la moitié du volume de la fine section de la pointe de la pipette) de cellules. Le volume des cellules en suspension n’a pas besoin d’être précis, car le volume du dispositif PDMS est faible par rapport à celui de la micropipette. Nous ne connaissons pas de limite supérieure à la densité des cellules en suspension réintégrée, tant que la suspension cellulaire peut être pipetée dans l’appareil. Les amas cellulaires peuvent boucher l’appareil et doivent être évités par un pipetage approfondi et/ou un mélange vortex.
4. Retirez doucement les embouts de chargement gel des trous de sortie, en travaillant un par un pour éviter les dommages à l’appareil.
5. Centrifugez l’appareil dans une microcentrifugeuse de laboratoire dans un adaptateur de rotor approprié à environ 6 000 x g pendant 10 minutes (Figure 2C).
   NOTE: Un adaptateur de rotor en aluminium usiné sur mesure, conçu pour s’adapter à un rotor de microcentrifuge (Figure 2C) était utilisé ; différents modèles de centrifugeuses peuvent être utilisés avec des adaptateurs de rotor appropriés. La caractéristique importante de l’adaptateur est qu’il fournit une force latérale dans la direction des extrémités fermées des tranchées des cellules, forçant ainsi les cellules dans les canaux latéraux.
6. Vérifiez le chargement réussi sous le microscope (Figure 3), mais sans fixer l’appareil sur le porte-lames/l’insert de l’étage.
   NOTE: Dans ce protocole, un objectif d’immersion Ph3 Ph3 de 60X et 1,4 NA est utilisé pour la vérification à ce stade et pour l’imagerie ultérieure.

6. Assemblage, équilibrage et montage du dispositif

1. Montez soigneusement l’appareil chargé sur un insert de scène en fixant le verre de couverture de chaque côté du PDMS au bas de l’insert de scène (c’est-à-dire inverser l’insert de scène avant d’attacher l’appareil). Inversez l’ensemble de l’étage insérant-dispositif de sorte que le PDMS soit orienté vers le haut et placez-le sur une surface souple, comme un essuyage sans poussière (Figure 2D).
2. Ajustez le débit de la pompe à seringue de phase 1 à 35 μL/min. En travaillant sur une voie à la fois, insérez l’aiguille d’entrée puis l’aiguille de sortie (c’est-à-dire en allant jusqu’au bécher à déchets ; Figure 2E).
3. Essuyez tout excès de substrat avec une lingette propre et sans poussière et inspectez l’appareil visuellement pour détecter des fuites. Examinez le tube de sortie pour détecter l’apparition de cellules en excès (généralement sous forme de bande trouble) et le ménisque médium, qui se déplacera lentement vers le bécher de déchets.
4. Laissez l’appareil fonctionner à 35 μL/min pendant environ 15 à 30 minutes, jusqu’à ce que toutes les voies connectées se déversent dans le bécher à déchets.
5. Réglez la pompe à seringue de phase 1 à 1,5 μL/min et mettez en pause le débit. Amenez l’ensemble de la pompe et de l’appareil au microscope (ce processus est facilité en le plaçant sur un chariot roulant) et redémarrez le flux de milieu de phase 1 à 1,5 μL/min. Montez soigneusement l’insert de la scène avec l’appareil sur un microscope à fluorescence inversée, en utilisant du ruban adhésif si nécessaire pour acheminer les tubes d’entrée et de sortie.
6. Localiser les positions souhaitées sur l’appareil pour l’imagerie et commencer à imager selon les besoins. Notez que les cellules nécessitent généralement quelques heures (environ 10 générations) pour atteindre une croissance exponentielle en phase stationnaire, et que le début de l’acquisition de l’image peut être retardé selon le souhait, de sorte que l’imagerie commence après la période d’équilibre.
   NOTE: La croissance en régime stationnaire des cellules maintenues en phase exponentielle doit être vérifiée lors de l’analyse d’image ultérieure en suivant les temps de division cellulaire et en s’assurant qu’elles ont atteint une valeur minimale constante.

Résultats

Figure 1 : Schéma du dispositif microfluidique. Un schéma de l’appareil est montré approximativement à l’échelle. Le désignateur alphabétique est indiqué avec les zones d’entrée et de sortie qui sont perforées pour connecter les aiguilles à...

Matériaux