Évaluation de la motilité bactérienne à l’aide d’un dispositif microfluidique

Abstract

Source : Scheidweiler, D., et al. Combiner des dispositifs fluidiques avec la microscopie et la cytométrie en flux pour étudier le transport microbien dans des milieux poreux à l’échelle spatiale. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un dispositif microfluidique pour quantifier la motilité bactérienne via une matrice poreuse composée de piliers disposés aléatoirement. Des bactéries marquées par fluorescence sont introduites dans l’appareil, imagées au microscope au fur et à mesure qu’elles traversent la matrice poreuse jusqu’au canal d’observation, puis analysées pour générer une courbe de percée (BTC).

Protocol

1. Conditions de culture bactérienne

1. En travaillant sous une hotte à flux laminaire, utilisez 100 μL d’un stock de glycérol de Pseudomonas putida KT2440 marqué par la protéine fluorescente verte (GFP) (1 × 10^{7 mL-1}, stocké à -80 °C) pour inoculer 5 mL de milieu Luria-Bertani (LB). Incubez à 30 °C tout en secouant à 250 tr/min pendant la nuit.
2. Le lendemain, resuspendez 100 μL de culture nocturne dans un milieu de 5 mL LB et incubez dans les mêmes conditions pendant 5 heures (phase exponentielle). Prélever une aliquote de 1 mL dans un tube de 2 mL, laisser refroidir à température ambiante (~15 min), puis centrifuger (2300 x g pendant 5 min).
3. Retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de tampon de motilité à la pastille. Vortex brièvement pour homogénéiser l’échantillon. Diluez pour atteindre la concentration cellulaire souhaitée, par exemple 5 x 10^{5 mL-1}.
4. Pour les expériences impliquant des communautés naturelles, comme celles issues de ruisseaux, préparez un milieu de culture non sélectif. Par exemple, utilisez de l’eau de ruisseau filtrée et autoclavée stérile ou un milieu artificiel d’eau de ruisseau modifié par une source de carbone complexe (milieu LB).

2. Préparation d’un dispositif microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS)

1. Concevez la géométrie poreuse souhaitée au moyen d’un logiciel de dessin assisté par ordinateur (CAO), qui consiste en une matrice de cercles (c’est-à-dire l’obstacle imperméable à l’écoulement), décrite par la taille du rayon et les coordonnées centrales.
   REMARQUE : Un exemple de géométrie poreuse avec des tailles de grains et de pores aléatoires est fourni à la Figure 1A. Un canal d’observation sans obstacles près de la sortie facilite l’acquisition des courbes de franchissement (BTC).
2. En fonction de la géométrie choisie, préparez un moule en utilisant la photolithographie standard SU-8.
   REMARQUE : Sinon, des moules peuvent également être commandés auprès d’une installation dédiée à la microfabrication. Pour obtenir un écoulement de fluide hétérogène dans le plan horizontal, il est important de concevoir l’épaisseur de la chambre microfluidique du même ordre de grandeur que la taille moyenne de la gorge des pores. Cependant, assurez-vous que les dimensions du dispositif microfluidique sont adaptées à l’observation au microscope (par exemple, travail sur des lames de microscope).
3. Préparez 50 g de PDMS en ajoutant 10 % de réticulation (diméthyl, copolymère de méthylhydrogène siloxane) à 90 % d’élastomère en poids, à l’aide d’une seringue sans aiguille. Travaillez dans des conditions propres et évitez la poussière autant que possible. Mélangez les deux réactifs dans un contenant propre et jetable et appliquez du vide (100 mbar) pendant 30 minutes pour éliminer l’air dissous et les bulles du PDMS visqueux.
4. Placez le moule dans une boîte de Petri (100 mm de diamètre, 15 mm de haut). Verser le PDMS sur le moule à la hauteur souhaitée (par exemple, 2 à 5 mm). Couvrez la boîte de Petri et gardez-la à 60 °C pendant 4 h (toute la nuit pour des couches plus épaisses) pour le sécher.
   REMARQUE : Pour la visualisation, la lumière devrait pouvoir passer à travers le PDMS ; Ainsi, une fine couche entre 2 mm et 5 mm est souhaitable. Les couches plus épaisses (>5 mm) réduisent la transparence de l’appareil, et les couches plus fines sont soumises à des déformations lors de l’application.
5. Retirez la moisissure du four et laissez refroidir le microfluidique à température ambiante. Une fois refroidi, retirez soigneusement la portion désirée de PDMS avec un scalpel.
   REMARQUE : De fortes pressions sur le moule provoquent des fractures de la moisissure. Ne touchez pas le PDMS à mains nues, car les empreintes digitales affecteront la transparence optique.
6. Scellez temporairement le bas du canal PDMS (où la géométrie souhaitée a été gravée) avec du ruban adhésif. Avec un perforateur de biopsie de 0,5 mm de diamètre, percez le canal microfluidique pour créer une entrée et une sortie raccordant le tube de 0,5 mm (diamètre intérieur).
   REMARQUE : La nature souple du PDMS garantit une étanchéité une fois le tube inséré. Les canaux d’entrée et de sortie ne peuvent pas être fabriqués après que le PDMS a été scellé au verre.
7. Scellez le canal microfluidique via une liaison plasma oxygène à l’aide d’un générateur haute fréquence (lieur plasma, Table of Materials). Pour cela, nettoyez une lame en verre silicaté (25 mm x 75 mm) avec de l’éthanol et laissez sécher. Retirez la bande du canal PDMS et placez le canal avec le côté poreux vers le haut. Traitez la lame en verre silicaté et les surfaces PDMS avec du plasma pendant environ 45 s à température ambiante.
8. Placez le canal PDMS sur la lame en verre silicate et chauffez à 100 °C pendant 30 minutes sur une plaque chauffante.
9. Retirez l’appareil microfluidique de la plaque chauffante et refroidissez-le à température ambiante. Relie l’entrée du canal PDMS avec un tuyau. Appliquer un vide pendant 30 minutes pour retirer l’air du PDMS, qui est presque imperméable aux fluides mais perméable aux gaz.
10. Préparez 100 mL de tampon de motilité (10 mM phosphate de potassium, 0,1 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA), complété avec 1 % de glucose/v, pH 7,0) et injectez 1 mL dans le dispositif microfluidique à l’aide d’une pompe à seringue fonctionnant à 10 μL ^min-1.
    REMARQUE : Comme le PDMS est sous-saturé en gaz (à cause de l’étape sous vide précédente), les bulles disparaîtront en ~30 minutes.

3. Analyser le transport bactérien à l’aide de dispositifs microfluidiques PDMS

1. Placez le dispositif microfluidique PDMS précédemment saturé avec le tampon de motilité sur l’étage du microscope. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le tube afin de minimiser la perturbation de l’écoulement lors du mouvement de l’étape.
2. Déplacez l’étage du microscope vers le canal d’observation près de la sortie. À l’aide de la microscopie en champ clair ou du contraste de phase, concentrez-vous sur le centre du canal d’observation et ajustez le grossissement pour visualiser les cellules bactériennes individuelles.
3. Passez les réglages du chemin de la lumière à la microscopie à fluorescence et ajustez le temps d’exposition de la caméra pour identifier les cellules bactériennes individuelles (par exemple, 100 ms), ou de façon à ce que les signaux de fluorescence des cellules soient au moins 3 fois plus forts que le bruit de fond.
4. Ensuite, insérez le tuyau d’entrée dans un tube de 2 mL contenant la suspension bactérienne. Inversez la direction de la pompe et commencez à retirer la suspension à un débit de 1 μL min-1.
5. Scannez la coupe transversale de l’ensemble du canal d’observation, enregistrant une image composite toutes les 2 minutes, sur toute la durée de l’expérience.

Results

Figure 1 : Dispositifs fluidiques pour étudier le transport microbien dans des milieux poreux (A) Illustration d’un dispositif fluidique broyé à partir de polyméthacrylate de méthyle (PMMA). La matrice poreuse est fraisée dans la couche de ...

Materials