Transfection d’un système d’expression génique inductible dans des cellules exprimant une protéine efectoire bactérienne

Résumé

Source : Berens, C. et al. Application d’un système d’expression inductible pour étudier l’interférence des facteurs de virulence bactérienne avec la signalisation intracellulaire. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système d’expression inductible pour identifier où la protéine effectrice bactérienne CaeB perturbe la cascade apoptotique de l’hôte. Il décrit les étapes pour transfecter les cellules exprimant CaeB avec un système sensible à la tétracycline afin d’induire l’expression génique pro-apoptotique afin d’identifier le point de perturbation au sein de la cascade.

Protocole

1. Transfection de la lignée cellulaire stable avec le système de vecteurs d’expression inductibles

1. Semez des cellules embryonnaires humaines de rein (HEK)293 exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP) ou GFP-CaeB dans une plaque à 12 puits à une densité de 1 x 10⁵ cellules/puits.
2. 19 heures après l’ensemencement, co-transfecter les cellules avec le plasmide régulateur et le plasmide de réponse, codant soit Bax, soit une caspase 3 activée.
   1. Co-transfectez les cellules SABLES HEK293 avec 100 ng de plasmide régulateur pWHE125-P (Figure 1) et 100 ng des plasmides de réponse pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figure 2) et 0,4 μl de polyéthylénimine.
   2. Préparez chacun l’acide désoxyribonucléique (ADN) et le réactif de transfection de polyéthyléminine dans 75 μl de milieu Opti-MEM et faites couver exactement 5 minutes à température ambiante (RT). Pour la formation complexe, incubez les deux mélanges ensemble pendant 15 minutes à la formation en temps récréatif.
3. Ajoutez la solution de polyéthyléniine/ADN goutte à goutte aux cellules et incubez à 37 °C dans 5 % de CO₂.

2. Induction de l’apoptose

1. 5 heures après la transfection, induire l’expression des protéines pro-apoptotiques par l’ajout de 1 μg/ml de doxycycline au milieu de culture. Incuber les cellules pendant 18 heures à 37 °C dans 5 % de CO₂.

Résultats

Figure 1. Aperçu schématique du plasmide régulateur pWHE125. Éléments essentiels à la propagation chez les bactéries, y compris une origine de réplication (ori pBR) et une cassette de résistance antibiotique contre l’ampicilline (Amp

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Technologies de vie	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pénétrographe/Streptocoque	Technologies de vie	15140-122
OptiMEM	Technologies de vie	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polyéthylénimine	Polyscienes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891