Détection de l’expression de l’enzyme cible dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées

Résumé

Source : Kim, H. et al., Dépistage multi-enzymatique utilisant un système de criblage enzymatique génétique à haut débit. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre une méthode de dépistage génétique permettant de détecter l’expression enzymatique à l’aide de bibliothèques de fosmides métagénomiques et de substrats chromogéniques. La cytométrie en flux identifie et isole des cellules individuelles produisant des produits colorés, permettant une sélection à haut débit des cellules actives exprimant des enzymes.

Protocole

1. Préparation de la bibliothèque métagénomique avec un système de criblage enzymatique génétique pour la détection du p-nitrophénol (pNP) (pNP-GESS)
   1. Construire une bibliothèque métagénomique dans Escherichia coli avec un vecteur fosmid à l’aide d’un kit de production de bibliothèque fosmid.
   2. Aliquote 100 μl de la bibliothèque pour le stockage à −70 °C, qui est une source de cellules bibliothèque métagénomiques.
      NOTE: La densité optique d’un échantillon mesuré à une longueur d’onde de 600 nm (OD₆₀₀) de ce stock de bibliothèque est d’environ 100.
   3. Dégelez 100 μl de la bibliothèque métagénomique standard sur de la glace et inoculez dans une fiole de 500 ml contenant 50 ml de Luria-Bertani (LB) et 12,5 μg/ml de chloramphénicol, suivie d’une incubation à 37 °C pendant 2 heures.
   4. Prélever les cellules dans un tube conique de 50 ml par centrifugation à 1 000 x g pendant 20 minutes à 4 °C.
   5. Resuspendez rapidement le pellet dans 50 ml d’eau distillée glacée (DW) et centrifugez à 1 000 x g pendant 20 minutes à 4 °C.
   6. Résuspendez le pellet dans un pavillon de 50 μl glacé avec 10 % (v/v) de glycérol. Utilisez 50 μl de cette aliquote de cellule pour l’électroporation.
   7. Placez le mélange de cellules électrocompétentes de 50 μl et d’ADN pGESS(E135K) (100 ng) dans une cuvette d’électroporation glacée et électroporez le mélange (1,8 kV/cm, 25 μF).
   8. Ajoutez rapidement 1 ml de bouillon super optimal avec un milieu de répression catabolique (SOC) et resuspendez doucement les cellules.
   9. Transférez les cellules dans un tube à fond rond de 14 ml à l’aide d’une pipette et incubez à 37 °C pendant 1 heure.
   10. Étalez 500 μl des cellules récupérées sur une plaque LB de 20 x 20 cm carrés contenant 12,5 μg/ml de chloramphénicol et 50 μg/ml d’ampicilline. Incubez l’assiette à 30 °C pendant 12 heures.
   11. Grattez les colonies à l’aide d’un grattoir à cellules et collectez les cellules dans un tube conique de 50 ml à l’aide d’un milieu de stockage cellulaire glacé.
   12. Centrifugez à 1 000 x g pendant 20 minutes à 4 °C. Résuspendez la pellete dans un milieu de stockage de 10 ml à cellules glacées pour atteindre un OD_{de 600} sur 100.
   13. Aliquote 20 μl des cellules pour le stockage à −70 °C.
        
2. Suppression des faux positifs de la bibliothèque métagénomique
   1. Décongeler sur glace les cellules bibliothèque métagénomique d’origine (de l’étape 1.13) contenant l’ADN métagénomique fosmid et pGESS(E135K).
   2. Inoculez 10 μl des cellules dans 2 ml LB contenant 50 μg/ml d’ampicilline et 12,5 μg/ml de chloramphénicole dans un tube à fond rond de 14 ml. Incubez à 37 °C avec des secousses à 200 tr/min pendant 4 heures.
   3. En attendant, allumez la machine de trieur de cellules activée par fluorescence (FACS) et ouvrez le logiciel FACS par défaut. Utilisez les réglages suivants : diamètre de la pointe de la buse, 70 μm ; Sensibilité à la zone de diffusion avant (FSC-A), amplification 300 V-logarithmique ; Sensibilité à la zone de dispersion latérale (SSC-A), amplification 350 V-logarithmique ; sensibilité à la zone isothiocyanate de fluorescéine (FITC-A), amplification 450 V-logarithmique ; paramètre seuil, valeur FSC-A 5.
      NOTE: Les réglages typiques sont donnés pour les dispositifs FACS mentionnés dans le tableau des matériaux. Ajustez les paramètres pour les autres appareils FACS.
   4. Diluez les cellules bibliothèque métagénomique de l’étape 2.2 en ajoutant 5 μl de l’échantillon dans un tube à fond rond de 5 ml contenant 1 ml de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS).
   5. Placez l’échantillon de bibliothèque dilué sur le port de chargement de l’instrument FACS et cliquez sur le bouton Charger dans le tableau de bord d’acquisition du logiciel FACS.
   6. Ajustez le taux d’événements à 1 000 à 1 500 événements/seconde en cliquant et en contrôlant les boutons de débit sur le tableau de bord.
   7. Créez un diagramme de points à échelle logarithmique FSC-A vs. scalé logarithmique SSC-A sur une feuille de calcul globale en cliquant sur le bouton Diagramme de points dans la barre d’outils. Ajustez la porte de diffusion R1 pour englober les événements de singlets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon Gate dans la barre d’outils.
   8. Tracez un histogramme avec le nombre de cellules par rapport au FITC-A à l’échelle logarithmique sur la feuille de calcul en cliquant sur le bouton Histogramme. Ensuite, ajustez la tension FITC depuis l’onglet Paramètres du cytomètre de la fenêtre de contrôle de l’inspecteur de sorte que le pic de la distribution en cloche soit inférieur à 10² de FITC-A.
   9. Créer un FSC-A à échelle logarithmique vs. le journal FITC-A trace en cliquant sur le bouton Diagramme de points dans la feuille de calcul globale. Réglez une porte de tri R2 sur le graphique à l’aide du bouton Polygon Gate de la barre d’outils afin que la porte soit située entre +5 % et -5 % de cellules du centre de la distribution (soit un total de 10 % de cellules autour du sommet de la courbe en forme de cloche).
   10. Placez un tube de collecte contenant 1,2 ml LB contenant 50 μg/ml d’ampicilline et 12,5 μg/ml de chloramphénicole à la sortie de l’instrument FACS et triez 10⁶ cellules satisfaisant à la fois les portes R1 et R2.
   11. Retirez le tube de collecte, le bouchon et délicatement le vortex.
        
3. Criblage enzymatique métagénomique
   1. Incubez les cellules triées (de l’étape 2.11) à 37 °C avec secouage à 200 tr/min jusqu’à ce que le OD₆₀₀ atteigne 0,5.
   2. Ajouter une solution d’induction par copie de 1 μl pour amplifier le nombre de copies intracellulaires de fosmid. Incubez les cellules pendant 3 heures supplémentaires à 37 °C avec des secousses à 250 tr/min.
   3. Pour préparer les cellules au tri, ajoutez 0,5 ml des cellules cultivées et un substrat approprié (p-acétate de nitrophényl, p-nitrophényl-β-D-cellobioside, ou phénylphosphate) dans un tube à fond rond de 14 ml à une concentration finale de 100 μM.
      1. Pour un échantillon témoin, ajoutez 0,5 ml des cellules cultivées de l’étape 3.2 dans un tube à fond rond de 14 ml. Ajoutez le même volume de PBS que le volume du substrat à l’étape 3.3.
   4. Incubez les deux échantillons à 37 °C avec des secousses à 200 tr/min pendant 3 heures.
   5. En attendant, préparez la machine FACS avec les mêmes configurations que l’étape 2.3.
   6. Ajouter 5 μl de cellules (pour le tri) et les cellules de contrôle dans deux tubes à fond rond de 5 ml contenant respectivement 1 ml PBS.
   7. Placez le tube contenant les cellules de contrôle sur le port de chargement du FACS et cliquez sur le bouton Charger dans le tableau de bord d’acquisition du logiciel FACS. Ajustez le taux d’événement à 1 000 - 3 000 événements par seconde en contrôlant les boutons de débit sur le tableau de bord.
   8. Créez un diagramme de points à l’échelle logarithmique FSC-A versus SSC-A à échelle logarithmique en cliquant sur le bouton Dot Plot dans la feuille globale du logiciel, puis ajustez la porte de diffusion R1 pour englober les événements singlets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon Gate dans la barre d’outils.
   9. Créez un diagramme de points FITC-A à échelle logarithmique versus FITC-A à échelle logarithmique en cliquant sur le bouton Dot Plot sur la feuille de calcul, et définissez une porte de tri R2 sur le graphique à l’aide du bouton Porte Polygonale de la barre d’outils afin que moins de 0,1 % des cellules négatives soient détectées dans la porte R2.
   10. Remplacez le tube d’échantillon de contrôle par le tube d’échantillonnage de tri, et ajustez le taux d’événements à 1 000 - 3 000 événements/seconde en contrôlant les boutons de débit sur le tableau de bord.
   11. Placez un tube de collecte contenant 0,5 ml LB à la sortie de l’instrument FACS et triez 10^{cellules de 4} cellules satisfaisant à la fois les portes R1 et R2.
       NOTE: Le critère de tri peut varier du top 0,1 % à 5 % du FITC-A dans la porte R2. Dans ce protocole, le 1 % des cellules les plus élevées a été collecté comme positif.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CopyControl	Épicentre	CCFOS110	Kit de production de bibliothèque Fosmid
Solution d’induction CopyControl	Épicentre	CCIS125	Solution d’induction par copie Fosmid
EPI300	Épicentre	EC300110	Cellule électrocompétente
pCC1FOS	Épicentre	CCFOS110	Vecteur Fosmid
Impulsioneur génétique Mxcell	Bio-Rad		Cuvette d’électroporation et système électroporat
FACSAria III	Becton Dickinson		Cytométrie en flux (machine FACS)
AZ100M	Nikon		Microscope
Ultraslim	Maestrogène		Éclairage LED
Tube conique de 50 ml	BD Falcon
Tube à fond rond de 14 ml	BD Falcon
Tube à fond rond de 5 ml	BD Falcon
P-nitrophényl phosphate	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrophényl β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
P-nitrophényl butylate	Sigma-Aldrich	N9876	Substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L, chlorure de sodium 10 g/L
Bouillon super optimal (SOB)	BD Difco	244310	Tryptone 20 g/L, extrait de levure 5 g/L, chlorure de sodium 0,5 g/L, sulfate de magnésium 2,4 g/L, chlorure de potassium 186 mg/L
Bouillon super optimal avec répression catabolique (SOC)		SOB, 0,4 % de glucose
2x extrait de levure tryptone (2xYT)	BD Difco	244020	Digestion pancréatique de la caséine 16 g/L, extrait de levure 10 g/L, extrait de levure 5 g/L
Supports de stockage cellulaires			2x bouillon YT, 15 % de glycérol, 2 % de glucose
pGESS(E135K)			Un vecteur d’ADN contenant dmpR, des gènes egfp avec leurs promoteurs appropriés, RBS et terminateur. Voir la référence 5 dans le manuscrit pour plus de détails.
Chloramphénicol	Sigma	C0378
Ampicilline	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Logiciel de cytométrie en flux Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % phosphate disodique, 0,024 % phosphate monopotassique, pH 7,4