In vitro Modèle de culture par lots pour imiter la fermentation du côlon par le microbiote intestinal humain

Résumé

Source : Ahmadi, S., et al. Un modèle de culture batch-in vitro visant à estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre une méthode pour modéliser la fermentation microbienne intestinale en incubant des échantillons fécales avec des fibres fermentescibles alimentaires dans des conditions anaérobies afin d’étudier la production de métabolites par le microbiote intestin.

Protocole

Toutes les procédures concernant la collecte d’échantillons ont été réalisées conformément aux directives IRB de l’institut.

PRUDENCE: Consultez les fiches de données de sécurité des matériaux appropriées et suivez les instructions et directives pour une formation appropriée au niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Suivez toutes les étapes de culture conformément aux règles standard de biosécurité et utilisez un cabinet BSL-2 en conditions aseptiques. De plus, les échantillons fécaux provenant de différents modèles et sujets humains peuvent présenter un risque potentiel de propagation de maladies à transmission microbienne. Consultez immédiatement un médecin en cas de blessure ou d’infection. De plus, l’utilisation d’échantillons de selles humaines et animales doit être approuvée par des comités éthiques institutionnels et doit respecter les protocoles d’utilisation des échantillons et des informations sur les sujets.

1. Préparation des médias culturels

1. Préparation du milieu culturel, neuf types de solutions de stock :
   1. Solution A (1 000 mL) : dissoudre 5,4 g de chlorure de sodium (NaCl), 2,7 g de dihydrogène phosphate de potassium (KH₂PO₄), 0,16 g de dihydrate de chlorure de calcium (CaCl_{2,2H 2}O), 0,12 g de chlorure de magnésium hexahydrate (MgCl_{2,6H 2}O), 0,06 g de tétrahydrate de chlorure de manganèse (MnCl_{2,4H 2}O), 0,06 g de chlorure cobalteux hexahydré (CoCl_{2,6H 2}O), et 5,4 g de sulfate d’ammonium (NH₄)2SO₄, dans de l’eau déionisée, portant le volume total à 1 000 mL.
   2. Solution B (1 000 mL) : dissoudre 2,7 g de phosphate d’hydrogène potassique (K_{2HPO 4}) dans de l’eau déionisée pour atteindre un volume total de 1000 mL.
   3. Solution de minéraux traces (1 000 mL) : dissous 500 mg d’éthylénédiamine-tétraacétate disodium (Na₂EDTA), 200 mg d’heptahydrate de sulfate ferreux (FeSO_{4,7H 2}O), 10 mg d’heptahydrate de sulfate de zinc (ZnSO 4,7H₂O), 3 mg de tétrahydrate de chlorure de manganèse(II) (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg d’acide phosphorique (H₃PO₄), 20 mg de CoCl 2,6H ₂O, 1 mg de dihydrate de chlorure cuprique (CuCl 2,2H₂O), 2 mg de chlorure de nickel(II) hexahydrate (NiCl_{2,6H 2}O) et 3 mg de dihydrate de molybdate de sodium (Na₂MoO_{4,2H 2}O) dans de l’eau déionisée pour atteindre le volume total de 1 000 mL.
      NOTE: Cette solution est sensible à la lumière, donc assurez-vous d’être conservée dans des tubes/bouteilles enveloppés de noir/noir ou d’aluminium.
   4. Solution vitaminique hydrosoluble (1 000 mL) : dissoudre 100 mg de chlorhydrate de thiamine (Thiamin-HCl), 100 mg d’acide D-pantothénique, 100 mg de niacine, 100 mg de pyridoxine, 5 mg d’acide P-aminobenzoïque et 0,25 mg de vitamine B12 dans de l’eau déionisée pour atteindre un volume total de 1 000 mL.
   5. Folate : solution de biotine (1 000 mL) : dissoudre 10 mg d’acide folique, 2 mg de D-biotine et 100 mg de bicarbonate d’ammonium (NH_{4HCO 3}) dans de l’eau déionisée pour atteindre un volume total de 1 000 mL.
   6. Solution de riboflavine (1 000 mL) : Dissoudre 10 mg de riboflavine dans 5 mM de solution HEPES (4-(2-hydroxyétyl)piperazine-1-acide éthanassulfonique) (1,19 g/L) pour atteindre un volume total de 1 000 mL.
   7. Solution d’hémine (10 mL) : dissoudre 5 000 mg d’hémine dans une solution de 10 mM d’hydroxyde de sodium (NaOH) (0,4 g/L) pour atteindre le volume total de 10 mL.
   8. Mélange d’acides gras à chaîne courte (10 mL) : Combinez 2,5 mL de N-valerate, 2,5 mL d’isovalérate, 2,5 mL d’isobutyrate et 2,5 mL : DL-α-méthylbutyrate.
      NOTE: Cette solution est recommandée à utiliser dans une hotte pour éviter les odeurs et les émanations.
   9. Resazurine (1 000 mL) : Dissoudre 1 g de resazurine dans de l’eau déionisée et porter le volume total à 1 000 mL.
2. Milieu utilisé pour la fermentation anaérobie in vitro
   1. Pour préparer ce milieu, mélangez 330 mL de solution A, 330 mL de solution B, 10 mL de solution de minéraux traces, 20 mL de solution vitaminique hydrosoluble, 5 mL de folate : solution de biotine, 5 mL de solution de riboflavine ; 2,5 mL de solution d’hémines, 0,4 mL de mélange d’acides gras à chaîne courte, 1 mL de Resazurine, 0,5 g d’extrait de levure, 4 g de carbonate de sodium (_{Na 2}CO₃), 0,5 g de cystéine HCl-H2O et 0,5g de trypticase, et ajoutez 296,1 mL d’eau distillée.
   2. Vérifiez le pH et assurez-vous qu’il est autour de 7,0 ; sinon, ajustez le pH avec 1 N HCl ou 1 N NaOH. Stérilisez en filtrant le milieu sous vide à l’aide d’un filtre bouteille sous la station de travail aseptique.
   3. Sinon, mélangez tous les composants (sauf les vitamines et les hémines) et l’autoclave à 121 °C pendant 20 minutes et laissez refroidir à température ambiante. Simultanément, filtrez-stériliser les solutions vitaminiques et héminées à l’aide de filtres membranaires de 0,22 μm et ajoutez-les au milieu autoclavé et refroidi avant la distribution.

2. Préparation de la chambre anaérobie et des matériaux nécessaires

1. Conservez tous les matériaux, solutions et outils nécessaires à l’expérience de fermentation dans la chambre anaérobie au moins 48 heures avant le début de l’expérience, afin de s’assurer que tout oxygène résiduel associé aux outils et à l’oxygène soluble dans les tampons/solutions est éliminé et que tous les matériaux sont acclimatés aux conditions anaérobies établies.
   NOTE: Matériaux nécessaires à l’intérieur de la chambre anaérobie (48 heures avant l’expérience au début) : (i) milieu de fermentation ; (ii) solution anaérobie (préparée selon la section 4.1), (iii) vortexer, (iv) balance de pesée, (v) étayes en mousseline, (vi) ciseaux, (vii) entonnoir, (viii) tubes de 1,5, 2,0, 15, 50 mL, (ix) pipettor (2, 20, 200 et 1 000 μL) et pointes de pipette compatibles, (x) pipette fusil et pipetes (5 et 10 mL), (xi) mouchoirs en papier, (xii) marqueurs, (xiii) supports pour différents tubes, (xiv) boîte à déchets, (xv) indicateur d’O2 et (xvi) vaporisateur à 70 % d’éthanol (désinfectant).

3. Préparation des tubes et fibres

1. Pèser 300 mg d’inuline et transférer dans un tube de 50 mL, suivi de l’ajout aseptique de 26 mL de milieu de fermentation déjà préparé et stocké dans la chambre anaérobie. Préparez un tube blanc pour chaque type d’échantillon fécal et chaque tube expérimental (selon le nombre de composés testés), en triple exemplaire.
2. Laissez ces tubes dans la chambre anaérobie pendant environ 24 heures pour permettre l’hydratation des échantillons avant de commencer l’expérience de fermentation. Assurez-vous que la température du tube est de 37 °C au moment de l’inoculation, donc enfermés les tubes dans l’incubateur dans la chambre anaérobie.

4. Préparation de l’inoculum

1. Solution de dilution anaérobie (au moins 48 h avant l’expérience de fermentation) : dissoudre 5 g de NaCl, 2 g de glucose et 0,3 g de cystéine HCl dans de l’eau déionisée et atteindre le volume total de 1 000 mL. Autoclave et stockez-le dans la chambre anaérobie au moins 48 heures avant utilisation.
2. Préparation de l’inoculum fécal (au jour de l’expérience de fermentation) : Pesez 5 g d’échantillon fécal frais dans un tube conique de 50 mL, ajoutez une solution de dilution anaérobie pour un volume final de 50 mL (1:10 p/v) et laissez passer pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que ce soit complètement homogénéisé. Filtrez le mélange homogénéisé à travers 4 couches d’étamine stérile (autoclave) et utilisez-le immédiatement pour l’inoculation dans les tubes contenant un substrat.
   NOTE: Les échantillons fécaux d’un groupe de sujets peuvent être regroupés si l’objectif expérimental est de comparer l’effet d’un composé ou d’un ingrédient donné sur le microbiote fécal globalement sain versus celui malade en général.

5. Fermentation et échantillonnage

1. Préparez les tubes selon la section 4.2 et inoculez les tubes blancs/témoins et expérimentaux avec 4 mL d’inocule fécal dilué et filtré. Incubez les tubes inoculés à 37 °C à l’intérieur de la chambre anaérobie. Secouez les tubes une fois toutes les heures en les inversant doucement pour resuspendre les fibres et l’inoculum.
2. Prélever des échantillons aussi fréquemment que nécessaire, par exemple toutes les heures jusqu’à 0, 3, 6, 9 et 24 heures pendant la fermentation en prélevant un échantillon de 2 mL d’aliquotes dans un tube de 2 mL provenant des tubes de fermentation respectifs.
3. Mesurer le pH des aliquotes à l’aide d’un pH-mètre de laboratoire (en insérant directement l’électrode de pH dans l’échantillon) ; centrifugez l’échantillon restant à 14 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Congelez immédiatement le surnageant et la pellete dans de l’azote liquide, puis après la congélation instantanée, stockez le surnageant pour l’analyse des SCFAs (acides gras à chaîne courte) et la pellete pour l’analyse du microbiome à -80 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	217255
Sulfate d’ammonium	TGI	C2388	Toxique
Chlorure de calcium dihydré	Sigma-Aldrich	C3306	Irritant
Chlorure cobalteux hexahydré	Sigma-Aldrich	255599
Chlorure cuprique dihydraté	Acros organiques	2063450000	Toxique, irritant
Cystéine-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotine	Sigma-Aldrich	B4501
Acide D-pantothénique	Alfa Aesar	A16609
Dihydrat disodium d’éthylénédiaminetétraacétate	Biorad	1610729
DL-α-méthylbutyrate	Sigma-Aldrich	W271918
Sulfate ferreux heptahydré	Sigma-Aldrich	F8263	Toxique
Acide folique	Alfa Aesar	J62937
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutyrate	Alfa Aesar	L04038
Isovalérat	Alfa Aesar	A18642
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma-Aldrich	M8266
Tétrahydrate de chlorure de manganèse	Sigma-Aldrich	221279
Niacin (acide nicotinique)	Sigma-Aldrich	N4126
Chlorure de nickel(II) hexahydrate	Alfa Aesar	A14366	Toxique
N-valérat	Sigma-Aldrich	240370
Acide P-aminobenzoïque	MP Chine	102569	Toxique, irritant
Acide phosphorique	Sigma-Aldrich	P5811
Phosphate de dihydrogène de potassium	Sigma-Aldrich	P5504
Phosphate d’hydrogène potassique	Sigma-Aldrich	1551128
Pyridoxine	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavine	Alfa Aesar	A11764
Carbonate de soude	Sigma-Aldrich	1613757
Chlorure de sodium	Fisher BioReagents	7647-14-5
Hydroxyde de sodium	Fisher Chemicals	S320
Molybdate de sodium dihydraté	Acros organiques	206375000
Chlorhydrate de thiamine	Acros organiques	148991000
Trypticase	BD Biosciences	211921
Vitamine B12	Sigma-Aldrich	V2876
Extrait de levure	Sigma-Aldrich	70161
Sulfate de zinc heptahydrate	Sigma-Aldrich	Z0251
Filtre à membrane de 0,22 μm
Billes magnétiques de purification AMPure	Agencourt
Chambre anaérobie avec incubateur	Système anaérobie forme, Thermo Scientific, États-Unis
Filtre à bouteille	Corning
Étamine
Ph-mètre
Tourbillon	Thermoscience