Fermentation microaérobie de l’hydrolysat de bambou par Klebsiella pneumoniae

Résumé

Source : Wei, D., et al., Production de produits chimiques par Klebsiella pneumoniae utilisant l’hydrolysat de bambou comme matière première. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la conversion microbienne de sucres dérivés du bambou en 2,3-butanediol en cultivant Klebsiella pneumoniae dans un milieu hydrolysé dans des conditions microaérobies et légèrement acides.

Protocole

1. 2,3-Butanediol Production par K. pneumoniae de type sauvage

1. Utilisez 3 L d’hydrolysat de bambou comme solvant pour la préparation du médium.
2. Préparez un milieu de fermentation contenant 4 g/L de liquide infusé de maïs, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K_{2HPO 4}, 3 g/L_{KH 2}PO₄ et 0,2 g/L_{MgSO 4}. Ajustez le pH du milieu au neutre avec 2,5 M de NaOH. Utilisez un bioréacteur de 5 L contenant 3 L de milieu de fermentation autoclavé pour la fermentation.
3. Utilisez des cellules de K. pneumoniae stockées dans un réfrigérateur à basse température à -80°C.
4. Pour la culture de graines, incubez une fiole de 250 mL contenant 50 mL de milieu Luria-Bertani (LB) toute la nuit à 37 °C, avec un secouement à 200 tr/min. Utilisez un milieu LB contenant 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl. NOTE: La densité cellulaire de la culture de graines devrait atteindre OD 2 (densité optique à 600 nm).
5. Inoculez une flasque de 50 mL de culture de graines dans le bioréacteur. Maintenez la culture à pH 6,0 et 37 °C. Utilisez un taux de supplémentation en air de 2 L/min et un taux d’agitation de 250 tr/min, créant ainsi une condition microaérobie.
6. Prélevez 5 mL d’échantillons toutes les 2 heures pendant la fermentation et analysez-les à la chromatographie liquide haute pression pour déterminer les concentrations chimiques dans le bouillon.
7. Surveillez l’alcali ajouté au bioréacteur en ligne à l’aide d’un système de pile à combustible microbien/acquisition de données ou MFCS/DA.
   NOTE: Des acides organiques sont produits lors du processus de fermentation, et du NaOH est ajouté pour maintenir le pH de la culture stable. Le volume d’alcali ajouté représente la quantité d’acide produite. Lorsque la ligne alcaline ajoutée se plafonne, le processus est terminé, soit à cause de l’épuisement des sources de carbone, soit de la mort cellulaire.

2. Production d’acétoïne de R-acétone par le mutant budC de K. pneumoniae

1. Préparez un milieu pour la production d’acétoïne contenant 4 g/L de liquide à maïs infusé, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L d’acétate de sodium, 0,4 g/L de KCl et 0,1 g/L de_{MgSO 4}.
2. Utilisez K. pneumoniae-ΔbudC pour la production de R-acétoyine. Répétez les étapes 1.4-1.5.
   REMARQUE : la budC code la 2,3-butanediol déshydrogénase. K. pneumoniae-ΔbudC perd l’activité de la 2,3-butanediol déshydrogénase et produit de la R-acétoïne au lieu du 2,3-butanediol.
3. Maintenir la culture à pH 6,0 et 37 °C. Utiliser un taux de supplémentation en air de 4 L/min et un taux d’agitation de 450 tr/min, une condition aérobie.
   NOTE: La supplémentation en oxygène est supérieure à celle de la production de 2,3-butanediol.
4. Analysez les échantillons comme à l’étape 1.6.

3. Production d’acide 2-cétogluconique par le mutant budA de K. pneumoniae

1. Pour la production d’acide 2-cétogluconique, utilisez le même milieu que pour la production de R-acétoyine.
2. Utilisez K. pneumoniae-ΔbudA pour la production d’acide 2-cétogluconique. Répétez les étapes 1.4-1.5.
   REMARQUE : budA code α-acétolactate décarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA perd l’activité de la décarboxylase α-acétolactate et produit de l’acide 2-cétogluconique, utilisant le glucose comme substrat.
   REMARQUE : La synthèse de l’acide 2-cétogluconique est un processus dépendant de la condition acide. Une fermentation en deux étapes a été développée pour la production d’acide 2-cétogluconique ; Lors de la première étape, la culture de graines est inoculée dans le bioréacteur.
3. Maintenez la culture à pH 7,0 et 37 °C. Utilisez un taux de supplémentation en air de 4 L/min et un taux d’agitation de 500 tr/min.
   NOTE: Dans ces conditions, les cellules croissent très rapidement (la densité cellulaire atteint OD 7 en environ 4 heures). Ensuite, la fermentation progresse vers la deuxième étape, durant laquelle le pH de la culture descend à 5,0. Aucun acide n’est ajouté ; les acides organiques produits dans la culture entraînent naturellement une diminution du pH. Dans ces conditions acides, la croissance cellulaire s’arrête, mais l’acide 2-cétogluconique est synthétisé et s’accumule dans le bouillon.
4. Analysez les échantillons comme à l’étape 1.6. Utiliser l’hydrolysat du bambou comme source de carbone.
   NOTE: Le glucose du milieu est converti en acide 2-cétogluconique, et le xylose est transformé en acide xylonique. Ainsi, un mélange d’acide 2-cétogluconique et d’acide xylonique est obtenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Autoclave	SANYO	3780
Bioréacteur	Sartorius Stedim biotech	Bostat Aplus
Agitateur	IKA	RW 20
Système de chromatographe liquide haute performance	Shimadzu Corp	20AVP
Poudre de bambou	Acheté dans la province du Zhejiang, Chine		Numéro de maillage : 50
Cellulase	Tu dis Biochemical, Shandong, Chine		200 PFU/mL