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1. Extraction de métabolites
- Dégelez des échantillons sur de la glace humide et perturbent les cellules dans un homogénéiseur avec quatre rafales de 30 s à 6 000 tr/min, avec des périodes de refroidissement de 2 minutes sur glace sèche entre les cycles.
- Clarifiez les lysats pendant 15 minutes dans une microcentrifugeuse pré-refroidie et réfrigérée à vitesse maximale (c’est-à-dire 18 213 x g à ≤4 °C).
- Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifuge propre.
- À l’aide d’une micropipette, transférer une petite portion de l’échantillon dans un tube microcentrifuge pour quantifier la teneur résiduelle en peptides à l’étape 2 ; stocker le reste à -80 °C.
NOTE: Le volume de l’échantillon réservé varie selon le test à l’acide bicinchoninique (BCA) utilisé à l’étape 2.1. Cet échantillon doit être stocké sur de la glace humide pour une analyse immédiate ou congelé à -80 °C.
2. Dosage à l’acide bicinchoninique (BCA)
- Effectuer un test BCA recommandé par le fabricant du kit, en utilisant des échantillons de l’étape 1.4 pour déterminer la concentration résiduelle de peptides pour chaque échantillon.
3. Chromatographie liquide - Spectrométrie de masse (LC-MS)
- Mélangez 75 μL d’extrait de Staphylococcus aureus (S. aureus) avec 75 μL de solvant LC-MS B, préparé à l’étape 1.4.
- Vortex pour mélanger et tourner à 13 000 x g pendant 5 minutes.
- Placez 100 μL de surnageant dans un flacon de chromatographie liquide (LC) et bouchez-le. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne soit piégée dans l’échantillon.
- Chargez les fioles LC sur l’autoéchantillonneur LC-MS et modifiez la liste en cours d’exécution dans le logiciel « Offline Worklist Editor ».
- Remplissez les colonnes « Nom d’échantillon » (par exemple, wildtype-1), « Sample Position » (par exemple, P1-A1), « Méthode » (par exemple, Méthode à acide formique-négatif) et « Data File » (par exemple, wild-type-1). Cliquez sur le bouton « Enregistrer la liste de travail ». Ouvrez le logiciel « Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation » et entrez la liste de travail précédemment enregistrée. Cliquez sur le bouton « Démarrer la liste de travail » pour lancer la mesure continue LC-MS.
- Séparer les échantillons sur une colonne, relier la colonne à un spectromètre de temps de vol (TOF), et couler le spectromètre TOF avec le système LC. Utilisez un gradient de phase mobile comme suit : 0-2 min, 85 % de solvant B ; 3-5 minutes, 80 % de solvant B ; 6-7 min, 75 % de solvant B ; 8-9 min, 70 % de solvant B ; 10-11,1 min, 50 % de solvant B ; 11,1-14 min, solvant B à 20 % ; et 14,1-24 min, 5 % de solvant B ; se terminer par une période de rééquilibrage de 10 minutes à 85 % de solvant B et un débit de 0,4 mL min-1.
- À l’aide d’une pompe isocratique, infusez une solution de masse de référence dans la piste pour permettre un calibrage simultané des axes de masse.
NOTE: Cette étape est basée sur le manuel standard du spectromètre TOF.- Utilisez le mélange d’acide acétique D4 et de phosphazine hexakis (1H, 1H, 3H-tétrafluoropropoxy) comme solution de masse de référence pour effectuer l’étalonnage en temps réel. Utilisez la pompe isocratique avec un débit de 2,5 mL min-1 pour l’infusion.
4. Correction par lots du nombre d’ions
- Désigner n’importe quel échantillon comme échantillon de référence pour la correction par lots (par exemple, wild-type, réplication 1).
- Calculez la somme des comptes d’ions pour tous les métabolites de l’échantillon de référence. Répétez ce calcul pour tous les échantillons.
- Divisez le nombre total d’ions de chaque échantillon par le nombre total d’ions de l’échantillon de référence pour générer un rapport.
- Divisez le nombre d’ions pour chaque métabolite au sein d’un échantillon par le rapport échantillon/référence afin d’obtenir un nombre d’ions corrigé par lots pour chaque métabolite.
5. Normalisation peptidique
- Divisez les valeurs de comptage d’ions corrigées par lots pour chaque échantillon obtenu à l’étape 4 par la concentration peptidique déterminée par le test BCA à l’étape 2 afin d’obtenir une valeur normalisée pour chaque métabolite.
NOTE: Les décomptes d’ions corrigés par lots et normalisés pour chaque métabolite obtenu à l’étape 5.1 peuvent être directement comparés entre souches et soumis à une analyse statistique (par exemple, un test U de Mann-Whitney). Alternativement, un métabolite connu pour être inchangé, que ce soit par le traitement ou par le contexte génétique, peut être utilisé comme normalisateur pour détecter des modifications dues à la décomposition du métabolite. L’inclusion d’une quantité connue de L-norvaline ou d’acide glutarique dans le tampon d’extraction peut être utilisée pour corriger les pertes lors du traitement de l’échantillon.