Surveillance de la croissance bactérienne dans des formulations de milieux distincts à l’aide d’un microbioréacteur automatisé

Résumé

Source : Hemmerich, J., et al. Protocole pour l’optimisation de la production de protéines hétérologues utilisant la technologie automatisée des microbioréacteurs. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un micro-opérateur automatisé pour surveiller la croissance bactérienne et la sécrétion de protéines fluorescentes en réponse à différentes formulations de milieux. Une bactérie génétiquement modifiée exprimant une protéine fluorescente sécrétoire est cultivée sous sélection antibiotique et inoculée dans des puits à variation nutritive. Les mesures optiques en temps réel de la densité cellulaire et de la fluorescence permettent une analyse comparative de la production de protéines à travers différentes conditions de croissance.

Protocole

1. Préparation des matériaux et procédures de définition
NOTE: Il est conseillé de définir et de fixer les méthodes expérimentales à un niveau détaillé. Cette standardisation garantit que différents résultats peuvent être attribués à une variabilité biologique intrinsèque ou à différentes compositions de milieux. ​
NOTE: Solutions de stock média : Préparez des solutions individuelles pour tous les composants médias étudiés. Préparez des stocks hautement concentrés pour permettre la dilution de différents volumes pour tous les composants. Cela signifie qu’après avoir combiné toutes les solutions de stock à leur volume le plus élevé selon le plan de conception, cela ne peut pas dépasser le volume final de culture, cf. paragraphe « Génération de solution moyenne de stock pour pipetage de liste » étape 1.3.3. Si l’ajout d’une solution très concentrée entraîne un volume d’addition très faible, par exemple < 1/100e du volume final de culture, diluez la solution de type stock en conséquence. Par exemple, dans cette étude, un volume de pipetage inférieur à 10 μL a été jugé irréalisable. Typiquement, les solutions d’éléments traces sont concentrées jusqu’à 1 000 fois par rapport à la concentration standard finale dans le milieu. Il est avantageux de concentrer les composants du milieu en multiples (X-multipliés) par rapport aux concentrations dans la recette de référence. Ce faisant, on évite des volumes de pipetage irréalisables de décimales fractionnaires. Des recettes détaillées pour toutes les solutions d’origine du médium CgXII sont données dans le document complémentaire.

1. Banque de cellules de travail (WCB)
Note : Pour chaque expérience de croissance, une aliquote WCB est utilisée. Si plus d’aliquotes sont nécessaires, utilisez un médium d’infusion cérébrale (BHI) de 100 mL dans des flasques de 1 000 mL de shake baffled ou inoculez plusieurs flasques shake, qui sont regroupées avant l’ajout de solution de glycérol.

1. Préparez des colonies uniques de la souche d’expression recombinante C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 sur des plaques d’agar (37 g/L de poudre BHI, 20 g/L d’agar, 25 mg/L de kanamycine). Le matériau de blindage peut provenir soit d’une transformation fraîche, soit d’une aliquote cryopréservée. Incuber à 30 °C jusqu’à l’apparition de colonies uniques ; cela prend généralement un à deux jours.
2. Inoculez une culture en flasque shaker (milieu BHI de 50 mL avec 25 mg/L de kanmycine, fiole déflectrice de 500 mL, 250 tr/min, diamètre de secouage de 25 mm, 30 °C) avec du matériau de la colonie et incubez toute la nuit (environ 16 h).
3. Combinez un volume de la suspension cellulaire résultante avec un volume de solution stérile de glycérol de 500 g/L et distribuez 2 mL d’aliquotes dans des fioles de cryoconservation stériles. Conserver à -80 °C.

2. Protocole de cultivation MBR
Note: Pour le système BioLector MBR utilisé dans cette étude, la lumière diffusée (biomasse) et la fluorescence GFP sont des mesures d’intensité, nécessitant une certaine valeur de gain attribuée. Plus le gain est élevé, plus le signal optique est amplifié ; C’est aussi pourquoi la lumière diffusée et la fluorescence sont mesurées en unités arbitraires (u.a.). Déterminer des valeurs de gain appropriées pour la détection de biomasse et de GFP lors des expériences préliminaires, ainsi que la fréquence de secouement et le volume de remplissage appropriés afin d’éviter la limitation de l’oxygène à des concentrations de biomasse plus élevées lors des étapes ultérieures du procédé. Les conditions de culture employées (« plaques de fleurs », c’est-à-dire des MTP en forme de fleur à 48 puits, fréquence de secouement de 1 200 tr/min, volume de remplissage de 1 000 μL, 10 g/L de glucose comme principale source de carbone) assuraient des cultures sans oxygène. Pour des taux maximaux de transfert d’oxygène résultant d’autres combinaisons de volumes de remplissage et de fréquences de secouement dans les MTP en forme de fleur à 48 puits, des fiches techniques sont disponibles auprès du fournisseur. De plus, des défauts de croissance des cultures individuelles peuvent survenir en raison de faibles quantités de substrats secondaires (par exemple, azote, oligo-éléments). Par conséquent, vérifiez les concentrations de biomasse à la fin de la culture. Dans cette étude, aucun effet de croissance de ce type n’a été observé.

1. Définissez le protocole de cultivation pour le système MBR (« BioLector ») comme suit :
2. Ensemble de filtres 1 : Biomasse, gain 14. Filterset 2 : pH, gain prédéfini. Filterset 3 : pO2, gain préréglé. 4 : GFP, gain 80.
3. Fréquence de secousse : 1 200 tr/min.
4. Température : 30 °C.
5. Durée du cycle : 15 min.
6. Temps d’expérience : manuel (La cultivation ne sera pas arrêtée automatiquement).

3. Génération de la liste de pipetage en solution de support moyen
Note: Presque tous les systèmes robotiques de manipulation de liquides sont capables de lire les actions de pipetage à partir de fichiers externes. En gros, les informations minimales nécessaires sont le volume de transfert et la position de la source du réactif, ainsi que la destination de chacune, représentée par une position de laboratoire sur la plateforme robotique et une cavité spécifique à l’intérieur du matériel. Cependant, des syntaxes différentes pour différents systèmes de manipulation des liquides doivent être prises en compte. La figure 1 montre un exemple de structure de fichiers pour le système de pipetage utilisé dans cette étude.

1. Quatre types de solutions de stock sont pipettés dans chaque puits de culture :

1. Solutions de stocks de composants de média variés (« Variations Stocks »).
2. De l’eau pour compenser les différents volumes cumulés des stocks mentionnés ci-dessus.
3. Une solution standard (« Stock de repos ») contenant tous les composants fixes. Cette solution de stock peut être composée de stocks contenant différents composants qui, par exemple, sont stockés à différentes températures ou stérilisés par différentes méthodes.
4. Inoculum, qui doit être ajouté comme dernier composant et posé sur la table de travail juste avant l’ajout pour éviter que les cellules ne se déposent.

2. Par puits de culture, calculer les volumes à transférer pour tous les composants du milieu selon :

Le volume à ajouter pour certaines actions de variation peut être nul, c’est-à-dire lorsque ce composant spécifique est omis.

3. Réviser tous les volumes calculés Vi pour obtenir des nombres appropriés. Les incréments de volume par pipet dans les pas de volume ne doivent pas être trop petits. Si nécessaire, ajustez la concentration des actions de variation. Par exemple, le volume minimal de pipetage ici était défini à 10 μL, et l’incrément minimal à 5 μL. En général, ces volumes doivent être définis en fonction de la précision et de la précision expérimentales pour la station de manipulation des liquides utilisée.

4. Calculer le volume du stock de repos contenant les composants fixes pour tous les puits comme suit :

où le volume cumulatif maximal du stock de variation est utilisé. Par conséquent, calculez les concentrations requises des composants fixes dans le stock de repos comme suit :

Préparez le repos en conséquence.

5. Par puits de culture, calculer le volume d’eau à ajouter comme suit :

6. Par puits de culture, listez tous les volumes à ajouter dans l’ordre suivant : V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Formatez la liste de pipetage selon les spécifications de la station de traitement des liquides, comme montré par exemple à la Figure 1.

2. Culture des semences, préparation automatisée des médias et début de la culture principale

1. Créez un protocole pour le robot de manipulation des liquides. Voir les figures 2 et 3 pour un exemple de protocole pour un système « Janus », implémenté dans le logiciel correspondant « WinPREP ». Le protocole doit prendre en compte les aspects suivants :

1. Inclure une durée suffisante de logements stériles avant la préparation des médias.

2. Inclure un nettoyage initial excessif et un lavage de toutes les embouts et tubes de pipetage.

3. Choisir des contenants de laboratoire appropriés pour les solutions de stock. Ici, les plaques de puits profondes avec 12 colonnes conviennent au stockage des Variations Stocks, car les huit pointes de pipetage peuvent plonger en parallèle dans les colonnes de puits. Cela accélère grandement la préparation des médias. Si des tubes réactifs de 15 mL ou 50 mL sont utilisés comme réservoirs, une seule pointe de pipetage peut y plonger simultanément. Pour d’autres stocks comme Water et Rest Stock, des creux de 100 mL sont utilisés, car ces solutions nécessitent des volumes plus élevés au total.

4. Fournir un volume total suffisant pour chaque solution de stock afin de compenser les volumes de déchets, les décalages de pipetage en hauteur de la hauteur, etc.

5. Insérer une invite utilisateur avant l’étape d’inoculation, en veillant à ce que cette étape soit réalisée immédiatement avant la procédure de culture des graines.

2. Préparez toutes les solutions de stock de manière stérile et conservez jusqu’à utilisation, dans des contenants appropriés, par exemple des tubes à essai stériles de 15 mL et 50 mL.
3. Stérilisez les plaques de puits profondes pour le stockage de la solution d’origine sur une table de travail, par exemple en les essuyant avec 70 % d’éthanol puis en séchant dans une hotte à flux laminaire.
4. Commencez la culture de graines en inoculant un milieu BHI de 50 mL contenant 25 mg/L de kanamycine avec une aliquote du WCB. Avant la culture MBR, préparez un inoculum frais et vital à partir de cultures de graines à croissance exponentielle en quantité suffisante.
5. Placez tout le matériel de laboratoire nécessaire sur la table de travail robotisée et versez les solutions de stock dans les fournitures correspondantes.
6. Commencez le flux de travail robotisé pour la préparation du substrat, afin que la dernière étape (l’inoculation) soit atteinte à temps avec le début de la culture des graines. Le temps d’exécution total du flux de travail robotique doit être évalué à l’avance. Ici, la durée totale était d’environ 1,5 h.
7. Prélever la culture de graines après environ 2 heures, puis chaque heure, pour surveiller la croissance par densité optique (OD₆₀₀). Après environ 5 heures, la culture atteint 3-4 OD₆₀₀ et est utilisée pour inoculer les cultures principales.
8. Placez la culture de graines sur la table de travail du manipulateur de liquides et poursuivez le protocole de préparation du milieu. Cultivation des phoques MTP après inoculation.
9. Placez le MTP de cultivation scellé dans l’appareil BioLector et lancez le protocole de cultivation prédéfini.
10. Éliminez les solutions restantes, conformément aux réglementations de biosécurité si nécessaire, et semez la culture à partir de la table de travail robotique. Nettoyez les laboratoires réutilisables et lancez le protocole de décontamination du manipulateur de liquides.

Résultats

Figure 1 : Capture d’écran de la liste de pipetage volumineux pour l’analyse de sensibilité. Les entrées de la première colonne attribuent un identifiant unique à tous les volumes d’une ligne ; cet identifiant est le numéro de puits MTP du ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Assiette fleurie	M2P-Labs	MTP-48-BOH	Pour la culture dans l’appareil BioLector
Feuille d’étanchéité	M2P-Labs	F-GP-10	Scellement stérile pour la Floriste
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Disponible gratuitement, installation MATLAB requise
Robot pipetage Janus	Perkin Elmer	n/a	Inclut l’installation du logiciel « WinPrep »
Microplaque de puits profond à 12 colonnes	E&K Scientific	EK-2034	Conteneur pour solutions de stock moyen
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	n/a	n/a	Porte le plasmide pEKEx2 avec fusion du gène GFP et du peptide signal PhoD de B.subtilis comme insert d’expression. Le plasmide offre une résistance à la kanamycine. Décrit et publié par Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)