Cryoconservation à long terme des souches cyanobactériennes utilisant le glycérol ou le sulfoxyde de diméthyle

Résumé

Source : Lea-Smith, D. J., et al. Génération de mutants marqués et sans marqueurs chez des espèces modèles de cyanobactéries. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre la cryopréservation des souches cyanobactériennes en combinant des suspensions cellulaires concentrées avec du glycérol ou du DMSO et en les stockant à basse température, permettant un maintien à long terme de cultures viables pour la photosynthèse et les études génétiques.

Protocole

1. Préparation des médias culturels

1. Préparez le BG11 moyen
   1. Préparez des solutions de base de 100x BG11, des oligo-éléments et du fond de fer (Tableau 1).
   2. Préparez des solutions séparées de stock phosphate, carbonate de sodium (Na₂CO₃), stock N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl], -2-amino-éthanessulfonique (TES) et bicarbonate de sodium (_{NaHCO 3}) (Tableau 1).
   3. Autoclave des stocks de phosphate et de Na₂CO₃ . Filtrez le tampon TES et le_{NaHCO 3} avec des filtres de 0,2 μm.
   4. Préparez BG11 en combinant 976 ml d’eau, 10 ml de 100x BG11, 1 ml d’oligo-éléments et 1 ml de bouillie de fer, puis autoclavez la solution. Après que cette solution aura refroidi à température ambiante, ajoutez 1 ml de bouillon de phosphate, 1 ml de bouillon Na₂CO₃ et 10 ml de_{NaHCO 3}.
   5. Pour un milieu solide BG11, ajoutez 15 g d’agar et 700 ml d’eau dans une fiole. À la deuxième fiole, ajoutez 3 g de thiosulfate de sodium (Na₂S₂O₃), 226 ml d’eau, 10 ml de 100x BG11, 1 ml d’oligo-éléments et 1 ml de bouillon de fer. Autoclave des deux solutions. Après que ces solutions ont refroidi à température ambiante, mélangez-les et ajoutez 1 ml de bouillon de phosphate, 1 ml de bouillon Na₂CO₃ , 10 ml de tampon TES et 10 ml de_{NaHCO 3}.
      NOTE: Les solutions sont préparées séparément pour éviter la précipitation de certains sels.
2. Pour la sélection sur le saccharose, préparez une solution de saccharose à 50 % (p/v). Filtrez, stérilisez la solution avec des filtres à 0,2 μm et ajoutez à BG11 (100 ml de saccharose à 50 % pour 900 ml de BG11) afin de produire des plaques de BG11/5 % de saccharose.
   NOTE: N’ajoutez pas de NaHCO₃ aux plaques d’agar de saccharose à BG11/5 %. Ajoutez Na₂CO₃ comme d’habitude.
3. Pour la culture de Synechococcus, ajoutez 10 ml d’acide M 4-(2-hydroxyétyl)piperazine-1-éthanassulfonique, N-(2-hydroxyéthyle)piperazine-N′-(2-acide éthanassulfurique) (HEPES) et 1 ml de vitamine B12 (Tableau 1) à 1 L de milieu BG11.
   NOTE: La transformation des souches cultivées dans des milieux BG11 disponibles dans le commerce est nettement moins efficace que dans les recettes de milieux BG11 décrites ici et n’est donc pas recommandée.

2. Stockage à long terme des souches

1. Installez une nouvelle culture de la souche en inoculant une boucle pleine de cellules dans 30 à 50 ml de milieu BG11. Faites pousser la culture pendant 3-4 jours jusqu’à une OD_{de 750 nm} = 0,4 à 0,7.
2. Lavez les cellules une fois avec du BG11 et resuspendez-les dans ~2 ml de BG11.
3. Ajoutez 0,8 ml de cellules concentrées dans un tube. Ajoutez ensuite 0,2 ml de glycérol stérilisé à 80 % au filtre.
4. Optionnel : Ajouter 0,93 ml de cellules concentrées dans un autre tube. Ajoutez 0,07 ml de DMSO à ce tube.
   PRUDENCE: Le DMSO est toxique et doit être manipulé avec une protection appropriée.
5. Conservez les deux tubes à -80 °C. Pour réanimer les souches, retirez le tube et grattez certaines cellules avec un cure-dent émoussé sur une plaque d’agar sans antibiotiques. Sortez comme d’habitude avec une boucle stérile.

Tableau 1 : Solutions utilisées dans cette étude

Recettes de solution en bouillon
Chimique	Montant (g)
100x BG11 (par L)
NaNO 3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Acide citrique	0.6
Ajouter 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0
0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (par 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Oligo-éléments (par 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4,2H 2O	0.039
CuSO4,5H 2O	0.008
Co(NO3)2,6H 2O	0.005
Bouillon de fer (par 100 ml)
Citrate d’ammonium ferrique	1.11
Bouillon de phosphate (par 100 ml)
K2HPO 4	3.05
BouillonNa 2CO3 (par 100 ml)
Na2CO3	2
Tampon TES, pH 8,2 (par 100 ml)
TES	22.9
NaHCO 3 bouillon (par 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (par 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamine B12 (par 50 ml)
Cyanocobalamine	0.02
Média Luria Bertani (par 500 ml)
Bouillon Luria Bertani	12.5
1 MMgCl 2 (par 100 ml)
MgCl 2,6H 2O	20.33
Solution A (par 200 ml)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morpholino)acide éthanasolisulfonique hydrate, 4-Morpholineéthanassulfonique (MES)	0.4265
Solution A + glycérol
Solution A de 10 ml
1,5 ml de glycérol

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Acide citrique	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Pêcheur	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrate d’ammonium ferrique	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pêcheur	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pêcheur	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cyanocobalamine	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Saccharose	Pêcheur	SUC001
Boîte de Petri de 90 mm triple éventée	Greiner	633185
Filtres 0,2 μm	Sartorius	16534
Fioles coniques de 100 ml	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion à haute fidélité ADN polymérase	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
Kit de purification de l’ADN	MoBio	12100-300
Endonucléases de restriction	ONÉ
Ligase T4	Thermo Scientific	EL0011
Bouillon Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Sulfate de kanamycine	Sigma	60615
Ampicilline	Sigma	A9518
Kit de minipréparation à plasmides GeneJET	Thermo Scientific	K0503
Tube à fond rond de 14 ml	BD Falcon	352059
GoTaq G2 Flexi ADN polymérase	Promega	M7805
Des billes de verre de 425 à 600 μm	Sigma	G8772
Glycérol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Ampoules fluorescentes	Gro-Lux	69
Photobioréacteur multitron HT	Infors