Modéliser la phagocytose médiée par le complément à l’aide de globules rouges opsonisés in vitro

Résumé

Source : Nagre, N., et al. Phagocytose des macrophages alvéolaires et élimination bactérienne chez la souris. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre l’évaluation de la phagocytose médiée par récepteur du complément en utilisant des globules rouges de mouton opsonisés avec IgM et complément, suivie de leur captation par les macrophages de souris. L’étendue de la phagocytose est quantifiée en mesurant un produit chromogénique bleu formé par oxydation catalysée par hémoglobine du diaminofluorène.

Protocole

1. Phagocytose médiée par FcγR et CR

1. Pour l’opsonisation, incubez 2 x 10^{globules rouges de mouton 8} (SRBC) avec 50 μL d’anti-SRBC-IgM de lapin ou 50 μL d’anti-SRBC-IgG de lapin pendant 30 minutes à température ambiante.
2. Incuber les SRBC opsonisés en IgM avec 50 μL de sérum humain carent en C5 (C5D) pendant 30 minutes à 37 °C afin de fixer les fragments complémentaires C3b et C3bi sur les SRBC enrobés d’IgM.
3. Semez les cellules macrophages murines (cellules MH-S) (10 000 cellules/puits) dans une plaque à 96 puits et incubez toute la nuit pour obtenir une confluence de ~70 %. Ajoutez 100 μL de 1 x 10 SRBC opsonisés de 10⁷/mL à chaque puits de cellules MH-S et incubez pendant 1 h à 37 °C. Lavez les SRBC non liés très rapidement (~1 min) avec 100 μL de tampon de lyse chlorure d’ammonium-potassium (ACK).
4. Lysez les cellules avec 0,1 % de SDS et ajoutez 50 μL de 2,7-diaminofluorène (DAF) contenant 3 % de peroxyde d’hydrogène et 6 de M urea. Mesurez l’absorption de la formation de bleu de fluorène catalysée par l’hémoglobine à 620 nm.
5. Déterminez le nombre de SRBC en utilisant une courbe standard à 620 nm avec un nombre connu de SRBC. De même, traiter les cellules MH-S incubées avec des SRBC non opsonisées pour les utiliser comme témoins négatifs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,7-diaminofluorène (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Grade de biologie moléculaire
70 % d’éthanol	Decon Labs Inc.	18C27 B	Grade analytique
Plaque à 96 puits	Corning	3603	Grade de biologie cellulaire
Tampon de lyse ACK	Technologies de vie	A10492	Grade de biologie moléculaire
Sérum déficient en C5	Sigma-Aldrich	C1163	Réactif biochimique
Centrifugeuse	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Numéro 11
Milieu de culture cellulaire DMEM	Gibco	11995-065	Grade de biologie cellulaire
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grade de biologie cellulaire
Cytomètre en flux	BD Biosciences	FACSCalibur
Logiciel Flow Jo	FlowJo, LLC
Pinces	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adapté à la dissection d’animaux de laboratoire
Plat à fond en verre	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Grade de biologie cellulaire
Seringue à haute pression	Penn-Century	FMJ-250	Adapté à l’utilisation chez les animaux de laboratoire
Homogénéiseur	Omni International	TH-01
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	H1009	Grade analytique
Microscope à fluorescence inversée	Olympe	IX73
MicroPulvérisateur aérosoliseur	Penn-Century	IA-1C	Adapté à l’utilisation chez les animaux de laboratoire
Paraformélélidoïde	Sigma-Aldrich	P6148	Qualité réactive
PBS	Gibco	20012-027	Grade de biologie cellulaire
Rabbit anti-SRBC-IgG	MP Biomédicals	55806	Adapté aux immuno-tests
Rabbit anti-SRBC-IgM	Laboratoires Cedarline	CL9000-M	Adapté aux immuno-tests
Ciseaux	Miltex	5-2	Adapté à la dissection d’animaux de laboratoire
globules rouges de mouton (SRBC)	MP Biomédicals	55876	SRBC lavés et conservés