Imagerie de la localisation bactérienne et de l’interaction de l’hôte dans le tissu pulmonaire humain

Abstract

Source : Mills, B., et al., Dépistage optique de nouvelles sondes bactériennes spécifiques sur tissu pulmonaire humain ex vivo par endomicroscopie laser confocale. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’imagerie en temps réel de Staphylococcus aureus marqué par fluorescence fluorescente dans les tissus en suspension et pulmonaires à l’aide d’une microscopie à fluorescence confocale fibreuse.

Protocol

1. Collecte de données par endomicroscopie laser confocale (CLE)
   1. Après la configuration, une fenêtre pour sélectionner l’emplacement de stockage et le préfixe du fichier s’ouvre. Sélectionnez le dossier souhaité pour le stockage des données, et nommez le préfixe en conséquence.
   2. Placez les pédales de façon à ce que l’opérateur puisse facilement y accéder. Pédale gauche : laser marche/arrêt ; pédale centrale : pause ; Pédale droite : Enregistrement/arrêt.
      REMARQUE : Les commandes laser sont également accessibles via les commandes à l’écran.
   3. Cliquez sur « démarrer » à l’écran ou appuyez sur la pédale du pied gauche pour allumer le laser. Cela déclenchera l’acquisition et l’obtention des images en utilisant 100 % de puissance laser et un taux d’images de 12 images/s (réglages par défaut).
      REMARQUE : Pour d’autres applications, ces réglages peuvent être modifiés à l’écran si nécessaire, selon le type d’échantillon.
   4. Imagez chacun des échantillons de suspension bactérienne.
      1. Insérez l’extrémité distale de la fibre d’imagerie FCFM (microscopie à fluorescence confocale fibrée) et déplacez lentement la fibre à travers la suspension pour examiner l’échantillon.
      2. Enregistrez des vidéos de n’importe quelle longueur (jusqu’à 10 minutes) en appuyant sur la pédale droite ou en sélectionnant les commandes d’enregistrement à l’écran, pendant que la fibre se déplace lentement autour de l’échantillon.
      3. Nettoyez l’extrémité distale de la fibre d’imagerie FCFM avec 8 % d’H_{, 2O2} et les tissus de nettoyage du cristallin entre les échantillons. ​
         REMARQUE : Des durées vidéo typiques de 10 à 30 s sont suffisantes pour l’imagerie in vitro .
   5. Imagez chacun des échantillons de tissu pulmonaire.
      1. Insérez l’extrémité distale de la fibre d’imagerie FCFM dans l’échantillon, en assurant un contact direct entre l’extrémité de la fibre et le tissu. Déplacez doucement l’extrémité de la fibre d’imagerie pour examiner l’échantillon.
         REMARQUE : Soulever l’extrémité de la fibre loin du tissu retirera le tissu du plan focal ; cependant, cela peut être utilisé pour imager des bactéries marquées qui ne sont pas adhérées au tissu.
      2. Enregistrez des vidéos de n’importe quelle longueur (jusqu’à 10 minutes) en appuyant sur la pédale droite ou en sélectionnant les commandes d’enregistrement à l’écran, pendant que la fibre se déplace lentement autour de l’échantillon.
         REMARQUE : En général, des durées vidéo de 30 s suffisent pour l’imagerie ex vivo sur tissu.
      3. Nettoyez l’extrémité distale de la fibre d’imagerie FCFM avec des tissus denettoyage de lentilles et 8 % d’H2_O2 entre les échantillons.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Petite microcentrifugeuse de laboratoire
Plaque à 96 puits	Corning	3370	Plaque d’essai
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Colorant fluorescent commercial
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Dispositif d’endomicroscopie laser confocal
Cletop-S	Cletop	14110601	Nettoyeur à fibres
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	Tube microfuge de 1,5 mL
Solution séline tamponnée phosphate de gibco	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - média de lavage
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Logiciel de collecte et de traitement des données pour le système de recherche CellVizio 488 nm
AlveoFlex de recherche non standard 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibre de microscopie à fluorescence confocale fibrée
Kit Quanti 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Kit d’étalonnage pour le système CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Souche bactérienne utilisée dans cette étude
Cuvette de spectrophotométrie semi-micro	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Pour la spectrophotométrie
Confort du thermomixeur	Eppendorf	41102422	Chauffage de plan de travail avec secousses