Nettoyage sélectif des vers de Caenorhabditis pour l’enrichissement du microbiote intestinal

Résumé

Source : Morgan, E., et al. Nettoyage sélectif des nématodes sauvages Caenorhabditis pour enrichir les bactéries du microbiome intestinal. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo illustre un protocole pour isoler les bactéries intestinales d’intérêt provenant des vers sauvages de Caenorhabditis . Les vers sont d’abord affamés puis lavés pour éliminer les bactéries résiduelles de leur lumière de surface et intestinale tout en préservant les microbes cibles. Après nettoyage de surface et plusieurs étapes de rampement, les vers sont disséqués pour extraire les intestins contenant les bactéries d’intérêt, qui sont ensuite collectés et congelés pour stockage.

Protocole

1. Dissection intestinale et identification par PCR des espèces microbiennes

1. Élever les animaux à 20 °C pendant 3 à 4 jours pour les laisser mourir de faim et réduire la quantité de bactéries OP50-1 (souche Escherichia coli OP50-1). Ajoutez 5 mL de substrat M9 à l’assiette des vers affamés.

2. À l’aide d’une pipette en verre stérile et d’un bulbe, faites remonter les vers M9+ depuis la plaque et transférez-les dans un tube centrifugeuse stérile de 15 mL.

3. À l’aide d’une centrifugeuse clinique, centrifugez les vers dans le tube à 1000 x g pendant 30 secondes à température ambiante.

4. À l’aide d’une pipette stérile de 15 mL, retirez le surnageant du tube centrifugeuse sans déranger les vers vivants au fond du tube.

5. Ajouter 10 mL de M9 + 0,05 % de Triton X-100 et incuber le tube sur un nutateur pendant 20 minutes pour éliminer les microbes externes. Répétez quatre fois pour laver les vers.

6. Après le dernier lavage, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, retirez le surnageant sans déranger la pellete au fond dans 100 μL de la solution.

7. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, transférez M9 et les vers sur une plaque NGM non semée et laissez la plaque sécher pendant que les vers rampent pendant 20 minutes pour aider à retirer l’OP50-1 de la cuticule et de l’intestin.

8. Ajouter 250 μL de M9 à la plaque séchée et utiliser une pipette en verre pour transférer M9+ vers vers vers sur une nouvelle plaque NGM non semée. Encore une fois, laissez sécher cette assiette et laissez les vers ramper pendant 20 minutes.

9. Ajouter 250 μL de M9 à la plaque et transférer 100 μL de vis M9+ vers une vitre de montre propre.

10. À l’aide de deux aiguilles stériles de 26 G, décapitez les nématodes en maintenant le ver avec une aiguille et en utilisant l’autre aiguille pour le couper. Après la décapitation, l’intestin (granulaire) et la gonade (transparente) du corps sortent naturellement du corps.

11. Coupez un morceau de l’intestin exposé en maintenant l’intestin avec une aiguille et en le coupant avec l’autre.

REMARQUE : Si possible, vérifiez que le microbe d’intérêt est toujours présent dans les intestins éversés à l’aide de la microscopie Normarski, de l’hybridation fluorescente in situ (FISH) ou de l’immunohistochimie.

12. Transférer un intestin disséqué dans un tube PCR de 0,5 mL contenant 10 μL d’eau stérile. Répétez pour un total d’au moins 5 tubes PCR (réaction en chaîne par polymérase) contenant des intestins provenant de différents animaux.

13. Gelez les tubes PCR à -80 °C pendant un minimum de 5 minutes. Retirez les tubes PCR du congélateur et décongelez les échantillons.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
10 % SDS	Invitrogen	AM9822
Aiguille BD PrecisionGlide - 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Strepttomycine	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tétracycline	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Des lunettes de montre	VWR	470144-850