Hybridation in situ par fluorescence des bactéries intestinales dans les sections intestinales de la souris

Résumé

Source : Ng, K. M., Tropini, C. Visualisation des interactions microbiote-hôte intestinal via l’hybridation fluorescente in situ , coloration des lectines et imagerie. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo illustre la procédure d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour colorer le microbiote intestinal dans le tissu intestinal de la souris en hybridant des sondes fluorescentes en ARNr bactérien (acide ribonucléique ribonucléique) et en contre-colorant les structures de l’hôte pour une analyse microscopique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animal approprié

1. Coloration bactérienne avec FISH (hybridation fluorescente in situ)
   1. Utilisez un bloqueur de liquide ou un stylo PAP (stylo barrière hydrophobe) pour limiter la zone d’expansion du liquide en contournant la zone de chaque section tissulaire. Assurez-vous que l’encre ne touche pas la section elle-même. Créez un cercle aussi près que possible de chaque section de tissu sans entrer en contact avec le tissu afin de minimiser la surface à recouvert par la solution d’hybridation.
   2. Préparez la solution d’hybridation : pour chaque 50 μL de solution d’hybridation préchauffée, ajoutez 0,5 μg de sonde (par exemple, 0,5 μL de sonde de 1 μg/μL). Pipettez la solution d’hybridation sur les sections de la lame (~20 μL/section, selon la taille de la section/cercle). Protégez la solution d’hybridation et les lames de la lumière à partir de ce point lors des étapes d’incubation et de stockage.
   3. Assurez-vous que le volume de liquide utilisé couvre toute la section lors de la superposition d’une couverture plastique flexible. Incubez la lame dans une chambre humide pour réduire l’évaporation. Créez une chambre humide avec une boîte à pointe de pipette avec des lingettes ou des essuie-tout au fond, trempées dans un excès de solution d’hybridation ou de solution physiologique phosphatée (PBS) pour fournir l’humidité. Incubez les sections à 45-50 °C, selon le jeu de sonde, pendant >3 heures.
   4. Réchauffer le tampon de lavage FISH : 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 0,9 M NaCl à 50 °C pendant la période d’incubation. Préparez suffisamment de tampon de lavage pour couvrir les lames dans le bocal Coplin.
   5. Retirez les couvercles en plastique ; incubez les lames dans un tampon de lavage FISH dans un bocal Coplin, tous deux pré-chauffés à 50°C. Remettez le bocal Coplin dans le four à 50°C pendant 10-20 minutes. Pour des échantillons épais, retirez les couvertures du bocal Coplin en ajoutant le tampon et en délogeant doucement les couvertures pour éviter d’étaler la tranche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pot de coplin	Fisher	08-813E
Verre de couverture, 22 × 22 mm, n° #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Résuspendu à 5 mg/mL
Boîte(s) à pointe de pipette vide			Pour faire fondre la paraffine
Sondes FISH
Solution d’hybridation FISH	--	--	20 mM de pH Tris–HCl 7,4, 0,9 M de NaCl, 0,01 % (p/v) de SDS dans de l’eau sans nucléase. Ajout optionnel de formamide de 5 à 50 % (v/v)
Tampon de lavage POISSON	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Lectine Ulex europaeus Agglutinin (UEA-1) marquée fluorescentement	Laboratoires Vector	FL-1061 (marqué à la fluorescéine) ou RL-1062-2 (marqué à la rhodamine)	UEA-1 marque les glycanes fucosylés, il n’est donc pas approprié pour les souris sans germes ni pour les échantillons d’hôtes déficients en fucosyltransférase 2 (FUT2).
Pinces
Cache-couvercle polyvalent HybriSlip, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	pour les étapes d’hybridation FISH, on peut remplacer par des cache-vêtements en verre
Stylo PAP barrière hydrophobe ImmEdge	Laboratoires Vector	H-4000
Kimwipes
Conteneurs polyvalents de stockage d’échantillons, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Vous pouvez remplacer par un contenant en verre ou en polyéthylène de votre choix. Le méthacarn n’est pas compatible avec le polystyrène ou le métal.
Vernis à ongles	Sciences de la microscopie électronique	72180	N’importe quel vernis à ongles devrait convenir
Four			Plage nécessaire : 45-60 °C
PBS, solution séline tamponnée phosphate (solution 10x)	Fisher	BP3991	Diluer à 1x pour le protocole
Chlorure de sodium	Fisher	S271
Solution d’hydrochlorure de Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Eau, sans nucléase	Fisher	BP2484100