1. Cultiver Legionella pneumophila
- Répandez la souche de L. pneumophila Corby (type sauvage, WT) sur des plaques d’agar d’extrait de levure de charbon tampon (BCYE) et incubez-les à 37 °C pendant 3 jours. Inoculez 10 mL de bouillon d’extrait de levure (YEB) à un OD600 de 0,3 avec L. pneumophila provenant de la plaque de préculture ; incubez les bactéries à 37 °C sur un shaker rotatif (150 tr/min) pendant 6 heures.
- Vérifiez la pureté de la culture liquide en étalant 100 μL de la suspension sur une plaque d’agar sanguin. Incubez toute la nuit à 37 °C.
- Ajoutez la culture liquide restante à 90 mL de milieu YEB frais et incubez sur un shaker rotatif (37 °C et 150 tr/min) pour atteindre un OD600 de 3,0-3,5, ce qui prend environ 16 à 20 heures.
2. Préparer et quantifier les vésicules membranaires externes (OMV) de L. pneumophila
REMARQUE : Effectuer toutes les étapes de centrifugation suivantes dans des conditions stériles et à 4 °C.
- Centrifugez la culture liquide à 4 000 x g pendant 20 minutes pour pelleter les bactéries. Transférez le surnageant dans des tubes centrifugeuses fraîches, jetez la pellete bactérienne, puis répétez la centrifugation (4 000 x g pendant 20 minutes). Répétez cette étape une fois.
- Filtre stérile le surnageant restant deux fois (taille des pores : 0,22 μm). Transférez le surnageant sans bactéries dans des tubes ultracentrifugeuses et ultracentrifugez à 100 000 x g pendant 3 heures.
- Décantez le surnageant et jetez-le. Resuspendez la pellete OMV dans une solution stérile tamponnée phosphate (PBS) et une ultracentrifugeuse (100 000 x g pendant 3 heures) pour éliminer les protéines contaminantes et le LPS.
- Jetez le surnageant et resuspendez la pellete OMV dans 500 μL de PBS stérile. Tracez 20 μL sur une plaque d’agar sanguine et sur une plaque d’agar BCYE pour exclure toute contamination bactérienne des vésicules préparées. Incubez la plaque d’agar sanguine pendant la nuit et la plaque d’agar BCYE pendant 3 jours (toutes deux à 37 °C).
REMARQUE : La concentration de 100 mL de culture de L. pneumophila est généralement de 1 μg/μL. Conservez les OMV préparés et quantifiés à -20 °C.
