Isolement et culture de Caenorhabditis elegans - Bactéries associées

Résumé

Source : Petersen, C. et al., Isolement et caractérisation du microbiote naturel du nématode modèle Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre l’isolement et la culture d’espèces bactériennes associées à Caenorhabditis elegans. Une lyse par billes de C. elegans, suivie d’une culture sélective, permet d’isoler diverses souches microbiennes pour une analyse ultérieure.

Protocole

1. Isolement et culture des bactéries associées aux nématodes (Figure 1)

1. Pour isoler les bactéries, préparez une plaque de 96 puits avec trois billes stériles de 1 mm, 20 μL de tampon M9 de sels moyens minimaux (M9) par puits, et pipettez un nématode individuel lavé vers chaque puits, en transférant le moins de liquide possible.
   REMARQUE : Alternativement, les populations de vers peuvent être lavées des plaques avec un tampon M9, et ~300 μL de tampon M9 contenant des vers peuvent être transférés dans des tubes de 2 mL contenant 10 à 15 billes.
2. Décomposer les nématodes à l’aide d’un homogénéiseur de billes (par exemple, battre les billes pendant 3 minutes à 30 Hz). Centrifugez brièvement la plaque ou les tubes pour faire descendre le liquide (par exemple, pendant 10 s à 8000 x g à température ambiante, RT).
   REMARQUE : L’utilisation de cette méthode a conduit à l’isolement de taxons bactériens similaires à ceux révélés par le séquençage de l’amplicon de l’ADN ribosomique 16S (ADNr), suggérant que le battement de perles décrit laisse la plupart des cellules bactériennes intactes.
3. Collectez le surnageant, diluez-le en série à 1:10, et plaquez jusqu’à 100 μL sur des plaques d’agar de 9 cm.
   1. Pour garantir que la plupart des bactéries puissent être cultivées, utilisez une variété de milieux alternatifs avec différentes compositions nutritives, notamment l’agar de soja trypticase dilué (TSA, dilution 1:10), l’agar MacConkey, l’agar glucose Sabouraud, l’agar dextrose de pomme de terre ou l’agar dextrose peptone à la levure.
4. Incubez les plaques aux conditions de température moyenne du lieu d’échantillonnage (par exemple, températures entre 15 et 20 °C pour les zones tempérées) pendant 24 à 48 heures.
5. Utilisez la technique standard des trois stries et une boucle stérile pour obtenir des cultures bactériennes pures (Figure 1).
   1. Retirez une colonie unique d’une plaque à l’aide d’une boucle stérile ou d’un cure-dent, puis étalez-la sur une nouvelle plaque d’agar contenant le même milieu d’agar que celui utilisé pour la purification. Veillez à n’utiliser qu’environ un tiers de la plaque.
   2. Soit utilisez une nouvelle boucle stérile, soit stérilisez une boucle réutilisable et faites-la passer dans la première bande pour créer une seconde bande sur un autre tiers de la même plaque.
   3. Répétez cette étape en faisant glisser une boucle stérile à travers la deuxième traînée.
   4. Incubez la plaque dans les mêmes conditions de croissance que celles pour l’isolation. Cette technique doit aboutir à la croissance de colonies uniques dans la zone de la troisième strie.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire de répéter l’étape de purification plusieurs fois, car les isolats naturels ont tendance à former des biofilms et/ou des agrégats.
6. Cultivez les colonies pures dans un milieu liquide (du même type que le milieu d’agar) en utilisant la même température et le même temps de croissance que ci-dessus (étape 1.4)

Résultats

Figure 1 : Identification des espèces et isolement de bactéries individuelles. Les nématodes individuels sont décomposés à l’aide d’un homogénéiseur de billes, et l’ADN est isolé pour la détermination de l’espèce par PCR ou séquençage. Alternativ...