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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement de la communauté bactérienne intracellulaire (CCI) : Pipettage buccal des CIR
REMARQUE : Toutes les méthodes décrites dans cette section ont fait l’objet d’une évaluation des risques institutionnels. La pipetage buccal comporte le risque inhérent d’ingestion de la solution transférée. Ce risque est largement atténué par les volumes de nanolitres utilisés par ce protocole, et nous recommandons à tous les utilisateurs du protocole de tenir compte des notes de précaution et de pratique listées ici et dans la discussion.
- Après que les cellules ont été rasées dans le PBS (solution physiologique tamponnée de phosphate), installez l’appareil de micropipetage buccal (Figure 1C).
- Insérez l’extrémité la plus épaisse du capillaire en verre tiré (l’extrémité non tirée) dans le bouchon en caoutchouc (extrémité blanche) du tube aspirateur.
- Insérez l’extrémité étroite d’une pointe de pipette de 1 mL dans l’autre extrémité ouverte (rouge) du tube aspirateur, assurant un ajustement serré.
- Insérez l’extrémité étroite d’une pipette aspirée de 2 mL dans l’extrémité ouverte et plus large de la pointe de la pipette de 1 mL, assurant à nouveau un ajustement serré.
REMARQUE : L’installation qui en résulte permet au chercheur de faire la pipette par la bouche à partir de l’extrémité plus large et ouverte de la pipette aspirante afin de créer une légère force d’aspiration à l’extrémité étroite du tube capillaire à l’autre extrémité de l’appareil. - Tester l’appareil final de micropipetage à la bouche à l’aide d’une boîte de Petri de 100 mm contenant de l’eau déionisée fraîche. Une légère aspiration à l’extrémité ouverte de la pipette aspirante (similaire à siroter une boisson à travers une paille) devrait augmenter le niveau de liquide dans le capillaire, sans provoquer le débordement de l’eau déionisée dans le tube aspirateur. Utilisez une main pour contrôler le tube capillaire, tandis que l’autre pour ajuster la position de la boîte de Petri.
REMARQUE : La force d’aspiration nécessaire pour pipeter un seul IBC par la bouche varie selon les chercheurs. Cependant, il est recommandé que chaque chercheur tentant cette technique commence par une succion faible et l’augmente progressivement si aucun liquide ne remonte le long du capillaire. Il n’y a pas besoin d’une force plus grande que de sucer une paille pour boire. Si le capillaire ne semble pas capter de liquide lors du test à l’étape 1.1.4, il est possible que le capillaire ou le tube aspirateur soient obstrués et doivent être remplacés. Il est également recommandé que tous les nouveaux chercheurs pratiquent d’abord le contrôle de la succion dans l’appareil de pipetage buccal à l’aide d’eau stérilisée. De plus, notez que le contrôle du volume absorbé par l’appareil de pipetage buccal se fait par l’utilisation de la langue du chercheur. La langue peut ajuster finement la force de la succion appliquée, ainsi que servir d’arrêt d’urgence. - Après avoir obtenu une captation réussie du liquide, testez la capacité à l’expulser par le capillaire en soufflant doucement à l’extrémité ouverte de la pipette aspirante. Veillez à ce qu’aucune bulle ne se forme lors de l’expulsion du liquide afin d’éviter la contamination des IBC lors de l’étape 1.5.
REMARQUE : Comme pour l’aspiration, la force de la pression positive appliquée par le chercheur pour expulser l’IBC dans le tube de centrifugeuse varie selon les chercheurs. Il est recommandé aux chercheurs débutants dans ce protocole de pratiquer l’étape 1.1 quelques jours avant l’infection réelle. Une suggestion pour pratiquer la micropipette buccale est de pratiquer le transfert de petits volumes d’eau stérilisée mélangée à quelques gouttes de colorant alimentaire (pour la visibilité) à l’aide de l’appareil de micropipette buccale.
- Placez la suspension de cellules grattées sous le microscope de dissection et identifiez les IBC comme de gros agrégats fluorescents (Figure 1A, B). La plage idéale de grossissement est de 20 à 40x. Trempez l’extrémité fine du capillaire en verre dans un tube frais de PBS pendant 1 seconde pour réduire l’absorption de volume indésirable par l’action capillaire.
- En regardant au microscope, identifiez le CCI d’intérêt et approchez lentement l’extrémité ouverte du tube capillaire vers le CCI. Utilisez l’extrémité fine du capillaire en verre pour balayer les cellules supplémentaires près de chaque IBC afin d’empêcher l’aspiration de deux cellules ou plus, ou pour briser des agrégats plus grands de cellules.
- En regardant au microscope, appliquez une très faible force d’aspiration à l’extrémité opposée (pipette à aspiration) de l’appareil de micropipette buccale pour guider l’IBC dans le capillaire en verre.
- Après avoir récupéré l’IBC, déplacez le capillaire vers un tube centrifugeuse vide de 1,5 mL et appliquez une légère pression positive pour expulser la gouttelette et l’IBC dans le tube centrifugeuse (Figure 1D).
- Répétez les étapes 1.3-1.6 sur autant d’IBC qu’il faut depuis la vessie actuelle, avant de passer à la vessie suivante. Changez fréquemment les pipettes et capillaires aspirants pour éviter l’accumulation de salive.
ATTENTION : Lorsqu’on travaille avec des souches infectieuses (ou cliniques) de bactéries, il faut surveiller constamment le niveau de solution dans le capillaire. Ne laissez pas le niveau de liquide pipeté déborder du bord du capillaire vers le tube aspirateur. Si cela se produit, changez immédiatement de tube aspirateur et jetez la configuration précédente. - Répétez les étapes 1.2-1.6 sur toutes les vessies prélevées, ou jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’échantillons biologiques ait été prélevé pour le groupe expérimental.
- (Optionnel) Répétez les étapes 1,6 et 1,7 jusqu’à ce que tous les groupes expérimentaux (ou souris) aient été euthanasiés et qu’un nombre suffisant d’échantillons biologiques aient été prélevés sur chaque groupe.
