Détection de l’expression du gène cible dans un cerveau de souris infecté par des bactéries

Résumé

Source : Zhang, S., et al. Voie subarachnoïde intracrânienne de l’infection pour l’étude des rôles de Streptococcus suis biofilms dans la méningite dans un modèle d’infection murine. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la détection de l’expression génique cible dans le cerveau d’une souris infectée par des bactéries. L’ARN est extrait, traité avec une enzyme dégradant l’ADN, puis rétrotranscrit en ADNc. L’ADNc est amplifié par cycle thermique avec des amorces spécifiques à chaque gène, tandis qu’un colorant liant l’ADN se lie à l’ADN amplifié, émettant de la fluorescence. Les signaux de fluorescence sont analysés pour confirmer la présence du gène cible.

Protocole

1. Préparation des bactéries

Note : La souche virulente de type 2 de Streptococcus suis (S. suis) P1/7 a été isolée chez un porc malade atteint de méningite. La souche P1/7 a été cultivée dans le bouillon Todd-Hewitt (THB, formule par litre de THB : Heart Infusion, 3,1 g ; néopeptone, 20,0 g ; dextrose, 2,0 g ; chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate de sodique, 0,4 g ; carbonate de sodium, 2,5 g) et dressée sur de l’agar Todd-Hewitt (THA, formule par litre de THA : Heart Infusion, 3,1 g ; néopeptone, 20,0 g ; dextrose, 2,0 g ; chlorure de sodium, 2,0 g ; phosphate disodique, 0,4 g ; carbonate de sodium, 2,5 g ; agar, 15,0 g) à 37 °C et 5 % de CO₂.

1. Collection des cellules planctoniques de la souche P1/7
   1. Prélever 5 mL de cellules planctoniques à partir d’une culture en phase moyenne logarithmique (ED₆₀₀=0,6), centrifuger pendant 3 minutes à 8000 × g, puis laver 3 fois avec du sérum tampon phosphaté (PBS).
   2. Resuspendez les cellules avec 5 mL de glycérol à 25 % dans THB, aliquotes dans 5 tubes, puis stockez à -80 °C.
2. Collecte des cellules d’état du biofilm de souche P1/7
   1. Prenez 20 mL d’une culture nocturne et ajoutez 180 mL de THB frais ; Divisez la culture diluée également en 10 plaques rondes, puis placez les plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 24 heures.
   2. Après l’incubation, secouez doucement la plaque pour resuspendre les bactéries qui n’y ont pas adhéré, puis jetez le surnageant par aspiration.
      REMARQUE : Secouez doucement la plaque et évitez de remettre en suspension le sédiment.
   3. Ajoutez 5 mL de PBS pour récolter les cellules d’état du biofilm, resuspendez complètement le sédiment, puis transférez l’échantillon dans un nouveau tube.
   4. Soniser les cellules d’état du biofilm à partir de la dernière étape avec les paramètres suivants : 60 W, 4 cycles, 5 s allumés et 10 s éteints.
   5. Centrifugez pendant 3 minutes à 8000 × g et stockez le surnageant à -80 °C.
      REMARQUE : Le surnageant peut contenir des composants de biofilm, et il peut être utilisé pour resuspendre les bactéries du biofilm avant l’infection, comme décrit dans les expériences animales (Étape 2).
   6. Resuspendez le sédiment avec 10 mL de glycérol à 25 % dans le THB, puis stockez les cellules de l’état biofilm à -80 °C.

2. Expériences animales

1. Utilisez des souris BALB/c femelles de 6 semaines avec SPF dans cette étude. Infecter toutes les souris par la voie subarachnoïde intracrânienne, dont le site d’injection est situé à 3,5 mm rostral du bregma.
   1. Pour une analyse histopathologique, infecter deux groupes de souris (5 souris par groupe) en utilisant des cellules planctoniques ou des cellules de l’état biofilm à une dose de 3 × 10 unités formant⁷ colonies (UFC), et 5 autres souris ont été injectées avec PBS comme témoin.
   2. Pour la détection de l’expression d’ARNm de TLR2 et de cytokines dans le cerveau, infectez deux groupes supplémentaires de souris (6 souris par groupe) en utilisant des cellules planctoniques ou des cellules à état biofilm à une dose de 3 × 10⁷ UFC.
   3. Déterminez le nombre de bactéries viables en plaquant les dilutions en série sur le THA.
   4. Euthanasiez toutes les souris à 12 heures après l’infection pour des recherches complémentaires. ​
      REMARQUE : Le glycérol contenu dans le milieu d’origine doit être retiré avant l’infection. Les cellules planctoniques et les cellules à état biofilm récupérées à -80 °C sont lavées 3 fois avec PBS. Ensuite, les cellules planctoniques sont remises en suspension avec du PBS et diluées à la dose appropriée pour l’infection ; Les cellules à état de biofilm sont resuspendues avec le surnageant stocké (à partir de l’étape 1.2.5) et diluées à la dose appropriée pour l’infection. Le volume d’infection ne doit pas dépasser 50 μL.
2. Détection de l’expression de l’ARNm de TLR2 et des cytokines dans le tissu cérébral
   1. Extraire l’ARN total du tissu cérébral à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.
      1. Pour chaque souris, utilisez tout le tissu cérébral pour extraire l’ARN. Divisez tout le tissu cérébral en 5 tubes. Prenez jusqu’à 100 mg de tissu cérébral et ajoutez 1 mL de solution de lyse à chaque tube contenant la matrice de lyse fournie par le kit.
      2. Traitez le tube dans un homogénéisateur pendant 40 s à un réglage de 6,0, puis centrifugez le tube à 12000 × g et 4 °C pendant 5 minutes.
      3. Après centrifugation, transférez la phase supérieure dans un nouveau tube microcentrifuge.
      4. Incuber l’échantillon transféré pendant 5 minutes à température ambiante ; ajouter 300 μL de chloroforme, utiliser un vortex pendant 10 s, puis incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
      5. Centrifugez le tube à 12000 × g et 4 °C pendant 5 minutes. Transférez la phase supérieure dans un nouveau tube.
      6. Ajoutez 500 μL d’éthanol absolu froid au tube avant de l’inverser 5 fois, puis stockez l’échantillon à -20 °C pendant au moins 1 heure.
      7. Centrifugez le tube à 12000 × g et 4 °C pendant 15 minutes et retirez le surnageant. Lavez le pellet avec 500 μL d’éthanol froid à 75 % dans de l’eau sans RNase (_H2O).
      8. Retirez l’éthanol, faites sécher la pastille à l’air libre pendant 5 minutes à température ambiante, puis remettez l’ARN en suspension dans 100 μL_d’H2Osans RNASE.
      9. Incubez l’ARN pendant 5 minutes à température ambiante et déterminez la concentration d’ARN à l’aide d’un bioanalyseur d’ARN.
   2. Effectuer une synthèse complémentaire d’ADN (ADNc), y compris l’élimination de l’ADN génomique (ADNg), à l’aide d’un thermocycleur avec un kit de réactifs à transcription inverse (RT).
      1. Ajoutez 1 μg d’ARN dans un tube contenant 2 μL de 5x tampon d’élimination d’ADNg, 1 μL d’enzyme d’élimination d’ADNg, et de_l’H2Osans RNase jusqu’à ce que le volume atteigne 10 μL. Incubez pendant 2 minutes à 42 °C.
      2. Ajoutez 10 μL de mélange maître (1 μL de mélange d’enzymes RT Mix I, 1 μL de mélange d’amorce RT, 4 μL de 5x Buffer 2, et 4 μL de H₂O sans RNASE) à la solution de réaction de la dernière étape, puis mélangez doucement. Procédez immédiatement à la réaction RT : 37 °C pendant 15 minutes puis 85 °C pendant 5 secondes.
      3. Effectuer l’analyse quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase (RT-qPCR) à l’aide d’une machine PCR en temps réel avec un kit SYBR RT-qPCR. Ajoutez 10 μL d’enzyme 2x, 0,8 μL d’amorce directe, 0,8 μL d’amorce inversée, 0,4 μL de colorant de référence ROX II 50x, 2 μL de gabarit d’ADNc, et H_2Osans RNase jusqu’à un volume total de 20 μL.
      4. Effectuer chaque échantillon en triple exemplaire en utilisant les paramètres thermiques suivants : 30 s à 94 °C, suivi de 40 cycles de 5 s à 95 °C, et 34 s à 60 °C, avec un étage final de 15 s à 95 °C, 1 min à 60 °C et 15 s à 95 °C. Les amorces pour RT-qPCR sont listées dans le Tableau 1. Les gènes de maintien B2m et 18s rRNA étaient utilisés comme contrôles internes.
   3. Calculez la variation relative du pli en fonction de la méthode ^2-ΔΔCt .

Tableau 1 : Amorces pour RT-qPCR.

Nom d’introduction	Séquence (5'-3')	Symbole génétique
IL-6 avant	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
Marche arrière de l’IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 en avant	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
TLR2 à l’envers	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Avant CCL2	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 reverse	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
Attaquant TNF-α	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
TNF-α inverse	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m en avant	GGTCTTTCTGTGTGCTTGTCT	B2m
β2m marche arrière	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18 secondes avant	GTAACCCGTTGAACCCCATT	ARNr 18
18s à l’envers	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	ARNr 18

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Todd Hewitt Bouillon (THB)	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	Dissouds 30 g de la poudre dans 1 L d’eau purifiée. Autoclave à 121° pendant 15 minutes.
Agar	DSBIO	16C0050	Dissouds 15 g de la poudre dans 1 L de THB. Autoclave à 121° pendant 15 minutes.
Système de Purification d’Eau de Référence Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Sans Dnase/Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glycérol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Dilué avec un volume égal d’eau purifiée, autoclave à 121° pendant 15 minutes
4 % de paraformoldéhyde	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25 % de glutaraldéhyde	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	Dilué dix fois avec de l’eau purifiée pour fixation.
Éthanol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Chloroforme	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Spctrophotomètre	DeNovix Inc.	DS-11+
Écraseur de cellules à ultrasons	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Centrifugeuse	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Réfrigérateur	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Green Kit	MP Biomédicals	#6045-050
FastPrep-24 Instrument	MP Biomédicals	116005500
Instrument pour la PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
Kit de réactifs PrimeScript RT avec gomme gDNA	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A