Délivrance en aérosol de Mycobacterium tuberculosis pour une infection pulmonaire dans un modèle murin

Résumé

Source : Mueller, A., et al. Un modèle expérimental pour étudier la coinfection tuberculose-paludisme sur la transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis et Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)

Cette vidéo montre l’administration en aérosol de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à la souris en utilisant un système de chambre à base de nébuliseur pour induire une infection pulmonaire, fournissant un modèle contrôlé et reproductible pour étudier la transmission aérienne de la tuberculose et les interactions hôte-pathogène in vivo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Infection par aérosol de souris avec un vtt à l’aide d’une chambre aérosol Glas-Col

La meilleure façon de standardiser l’infection par aérosols chez les animaux expérimentaux atteints de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) est d’utiliser des mycobactéries issues de stocks congelés avec des titres connus pour les unités formatrices de colonies. Pour préparer les cultures de type stock, on cultive du MTB dans un bouillon Middlebrook 7H9 complété avec un milieu d’enrichissement OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase) et 0,05 % Tween 80, une source de carbone pour les mycobactéries, et des mesures pour éviter les agglomérations bactériennes sont prises simultanément. Les cultures doivent avoir une densité optique (OD) ≤ 1 au moment de la récolte. À une OD plus élevée, les agglutinements bactériens augmentent et la viabilité diminue. Conservez 1 ml d’aliquotes à -80 °C. Déterminez le nombre d’UFC viables dans les stocks congelés en dressant une série de dilutions 10 fois multipliées de trois flacons indépendants sur des plaques d’agar 7H11 complétées avec 0,5 % de glycérol, 1 g/L d’asparagine et d’OADC, et en énumérant les colonies après 4 semaines d’incubation à 37 °C. Effectuez l’infection par aérosols comme décrit ci-dessous.

1. Décongelez des stocks de TCT de titer CFU connu et mélangez soigneusement la suspension cinq fois pour disperser les amas bactériens à l’aide d’une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 27 G. Évitez la production d’aérosols.
2. Selon la dose d’infection souhaitée, transférez le volume requis du stock mycobactérien dans un tube de 50 ml contenant une solution stérile tamponnée phosphate (PBS). Le volume final fait 6 ml.

REMARQUE : En variant le nombre de micro-organismes dans cette suspension, la proportion de bactéries portant des gouttelettes d’aérosol est variée. Nous visons généralement une captation de 100 bacilles viables par poumon (infection à faible dose). D’après notre expérience, cela nécessite environ 1 à 2 × 10⁶ Mtb/ml sur un volume total de 6 ml, dont 5,5 ml sont nébulisés. Il est recommandé de réaliser une série d’essais expérimentaux d’aérosols avec différentes concentrations de bactéries afin de trouver les conditions idéales pour votre infection. Alors que des infections à forte dose pouvant atteindre 5 000 mycobactéries peuvent être pratiquées pour accélérer le processus infectieux, aussi peu que 5 bactéries peuvent être utilisées pour infecter efficacement les souris par aérosol. Le taux d’infection est généralement de 100 %.

3. Retirer un volume suffisant (préparé au-delà du volume final requis) pour le placage afin de déterminer le titre de l’inoculum ; Nous retirons généralement 500 μl pour plaquer des triplicates techniques.
4. Placez les animaux dans un panier en maille compartimentée (une souris par panier) à l’intérieur de la chambre circulaire en aérosol et fermez le couvercle de la chambre en aérosol.

REMARQUE : D’autres modèles sont équipés d’un panier en forme de tarte composé de cinq compartiments individuels, chacun pouvant accueillir 20 souris.

5. Fixez l’unité de nébuliseur Venturi aux trois joints de douille en acier inoxydable.
6. Retirez la suspension mycobactérienne du tube de 50 ml avec une seringue de 10 ml équipée d’une aiguille émoussée de 18 g et transportez la seringue jusqu’à la chambre aérosol, dans une boîte de transport fermée.
7. Retirez le bouchon à vis de l’unité de nébuliseur et injectez soigneusement la suspension mycobactérienne dans le nébuliseur. Évitez la production d’aérosols. Jetez la seringue dans un récipient à objets tranchants contenant 2 % de Buraton. Scellez le nébuliseur avec le bouchon à vis.
8. Allumez l’interrupteur principal et la lampe UV. L’affichage sur le clavier de contrôle affiche « Glas-Col Apparatus Co ».
9. Allume l’interrupteur du programme. L’affichage affichera « Le nébuliseur est-il prêt ? » « Le panier est-il chargé ? » Appuyez sur entrée quand vous êtes prêt. » Appuyez sur entrée.
10. L’affichage affiche « Enter Preheat Time 900 » ; Cela signifie que le temps de préchauffage de l’incinérateur (qui décontamine l’air d’échappement) est de 900 secondes. Appuyez sur Entrée.
11. L’affichage affichera « Entrer le temps de nébulisation 1 800 » ; Cela signifie que le temps de nébulisation est réglé par défaut à 1 800 secondes. Pour prolonger le temps de nébulisation, entrez « 2 400 » et appuyez sur entrée.

REMARQUE : Pendant le cycle de nébulisation, l’air sous pression atomise la suspension, générant ainsi de petites gouttelettes d’aérosol contenant des mycobactéries. Avec le flux d’air principal, ces gouttelettes (d’environ 2 à 5 μm de taille) sont transportées dans la chambre aérosol.

 

12. L’affichage affichera « Entrer l’heure du CD 1 800 » ; Cela signifie que le cycle de désintégration prend 1 800 secondes. Réglez sur « 2 400 » et appuyez sur Entrée.

REMARQUE : Au cours de ce cycle, le nuage accumulé dans la chambre d’aérosol pendant le cycle de nébulisation peut se désintégrer. Les petites gouttelettes sont inhalées par les animaux expérimentaux.

13. L’affichage affichera « Enter Dec Time 900 » ; cela signifie que le cycle de décontamination à la lumière UV prendra 900 secondes. Appuyez sur entrée. La machine commence à passer par la préchauffe, la nébulisation, la dégradation des nuages et la décontamination UV.
    ATTENTION : Le débitmètre à vide doit indiquer 60 pieds cubes/h (vérifiez quand commence le cycle de préchauffage ; ajustez la vanne de contrôle du vide si nécessaire) et le débitmètre d’air comprimé 10 pieds cubes/heure (vérifiez quand commence le cycle de nébulisation ; ajustez la vanne de contrôle d’air en conséquence).
14. Une fois le cycle terminé, le clavier affichera « Processus terminé – Retirer l’échantillon ». Éteignez le programme, les UV et l’interrupteur d’alimentation principal.
15. Vérifiez si la suspension mycobactérienne a été complètement nébulisée et, sinon, notez le volume restant en retirant soigneusement la suspension avec une seringue appropriée équipée d’une aiguille émoussée de 18 G. Le volume restant ne doit pas dépasser 1 ml.
16. Retirez le nébuliseur des joints et placez-le dans une casserole contenant un buraton à 2 % pendant au moins 2 heures, généralement la désinfection se fait en O/N. Ensuite, transférez le nébuliseur dans une poêle fraîche et rincez soigneusement à l’eau. Laissez le nébuliseur sécher à l’air libre.
17. Ouvrez la chambre aérosol et ramenez les animaux dans leurs cages. Emballez les paniers dans des sacs d’autoclave et de l’autoclave. Nettoyez les surfaces de l’intérieur de la chambre aérosol avec du Buraton à 2 %.

REMARQUE : Pour des raisons de sécurité, un respirateur purificateur d’air motorisé doit être porté pendant cette intervention.

18. En utilisant les 500 μl restants de la suspension mycobactérienne (voir étape 1.3), plaquer des dilutions 10 fois d’un tripliqué technique (3 x 100 μl) sur des plaques d’agar 7H11.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Buraton	Schülke		Ingrédients actifs : aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde, oxalaldéhyde, éthyl hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Pour les cultures de bouillon de VTT
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Milieu agar pour la culture du MtB
Milieu d’enrichissement OADC Middlebrook	BD Biosciences	212240	Ajoutez à 7H9 et 7H11 pour la culture du VTT
Système d’exposition à l’inhalation	Glas-Col
Nebuliseur-Venturi	Glas-Col