Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

Résumé

Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la souris au fil du temps, les chercheurs peuvent suivre de manière non invasive la dynamique des infections et quantifier l’intensité du signal bioluminescent.

Protocole

1. Préparation et croissance des bactéries

1. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux disposant des précautions BSL-2 conformément aux directives du comité institutionnel de biosécurité et du comité d’utilisation des animaux du chercheur. Effectuez toutes les étapes décrites ici impliquant P. aeruginosa, y compris l’inoculation de la souris, dans un cabinet de biosécurité.
2. La souche luminescente PAO1 :lux de P. aeruginosa est disponible sur demande auprès de notre laboratoire. Streak PAO1, stocké sous forme de bouillon de glycérol congelé, sur agar Lysogeny Broth (LB). Pour la souche luminescente PAO1 :lux, l’agar LB devrait contenir des antibiotiques sélectifs (100 μg/mL de carbénicilline et 12,5 μg/mL de kanamycine). Faites pousser à 37 °C toute la nuit dans un incubateur bactérien.
3. Choisissez une colonie isolée et cultivez toute la nuit à 37 °C dans 3 ml LB de substrat, pH 7,4. Pour les souches luminescentes, le bouillon doit contenir 100 μg/mL de carbbénicilline. Poussez en conditions de secouement et aérobie.

2. Préparation à la procédure

1. Faites porter à tout le personnel opérant une blouse propre/blouse de laboratoire, un masque facial, un filet à cheveux et des gants.
2. Autoclave de tous les instruments chirurgicaux, y compris ciseaux et pinces. Utilisez une technique aseptique pour stériliser les outils entre animaux.
3. Nettoyez la table chirurgicale avec de l’éthanol et préparez un champ chirurgical propre.

3. Épilation

1. Anesthésiez des souris C57BL/6J âgées de 8 à 12 semaines en utilisant de l’isoflurane à 1 % à 3 %. Les chercheurs doivent suivre les recommandations du personnel vétérinaire de leur établissement pour l’anesthésie lorsqu’ils utilisent de l’isoflurane.
   1. Commencez l’anesthésie en administrant de l’isoflurane à 1 % à 3 % et ajustez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction.
   2. Pincez l’orteil de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie. Lorsque la souris ne répond plus à la stimulation, retirez-la de la chambre d’induction et placez-la sur le banc chirurgical avec le nez dans le cône d’isoflurane.
   3. Appliquez du lubrifiant oculaire sur les deux yeux.
2. Peser la souris pour obtenir un poids de base avant la procédure.
3. Placez la souris en position couchée. Injecter la souris par voie sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préchauffé à 0,9 %, 250 μL sur chaque flanc, pour un total de 500 μL.
4. Rase la zone dorsale de la souris à l’aide d’un rasoir électrique. Le rasage doit se faire à un endroit différent de la station chirurgicale afin d’éviter la contamination des cheveux de la plaie.
5. Appliquez une fine couche de lotion dépilatoire. Laissez la lotion reposer pendant 20 à 60 secondes. Retirez les poils et l’excès de lotion avec de la gaze humidifiée dans de l’eau tiède. Après l’épilation, procédez à la procédure de lésions excisionnelles.

4. Chirurgie excisionnelle de la plaie à pleine épaisseur

1. Injectez de la buprénorphine à libération prolongée 0,6–1 mg/kg par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 25 G au niveau du dosal moyen de la souris. La buprénorphine à libération lente soulage la douleur sur 48 à 72 heures.
2. Désinfectez le site opératoire. Essuyez la surface dorsale avec un prélèvement stérile de bétadine stérile. Essuyez l’excès de Bétadine avec un éponge d’alcool stérile. Cela doit être effectué 3 fois (en alternant entre bétadine et alcool), en préposant en se déplaçant du centre de manière circulaire vers le bord. Laissez la zone sécher à l’air libre.
3. Créez un drapé autour du site chirurgical à l’aide de gaze stérile ou de film plastique plastique.
4. Étirer la peau tendue, prudemment. Utilisez une poinçonne de biopsie cutanée stérile de 6 mm de diamètre pour effectuer une incision initiale à travers l’épiderme dorsal gauche. Répétez sur l’épiderme dorsal droit.
5. Utilisez des pinces pour faire une tente sur la peau depuis le centre de la zone de la plaie à gauche. Retirez les couches épidermique et dermique à l’aide de ciseaux. Répétez sur la zone de la plaie délimitée à droite pour créer des blessures excisionnelles symétriques.
6. Laver les plaies avec 50 μL de solution saline stérile. Laissez le site chirurgical et la peau environnante sécher à l’air libre. Ensuite, couvrez les plaies et le dos avec un pansement transparent en film plastique.
7. Remettez la souris dans une cage propre. Maison 1 animal par cage.
8. Placez la cage sur un coussin chauffant et un écran jusqu’à ce que la souris se réveille.
9. Lors de la réalisation de cette chirurgie sur plusieurs animaux, utilisez un stérilisateur à billes chaudes pour nettoyer tous les instruments chirurgicaux entre les animaux.
10. Laissez 24 heures aux souris pour récupérer de la procédure chirurgicale et pour former une matrice provisoire de plaie sur les plaies avant de procéder à l’inoculation avec des bactéries.

5. Inoculation avec P. aeruginosa

1. Diluer la culture PAO1 :lux pendant la nuit à OD600 = 0,05 dans 75 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL de carbénicilline et faire croître la bactérie jusqu’à ce que la culture atteigne une phase exponentielle précoce (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Cela devrait prendre environ 2 à 3 heures.
2. Diluez PAO1 : lux dans PBS à une concentration de (7,5 ± 2,5) x 10² UAC/mL. Veillez à préparer un excès d’inoculum pour garantir un volume suffisant et permettre le plaquage après l’expérience. Si vous transportez entre les installations (c’est-à-dire du laboratoire au vivarium), utilisez un double confinement dans une boîte étanche clairement marquée Biohazard.
3. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les souris en utilisant un équipement de protection individuelle approuvé dans un cabinet de sécurité biologique (BSC) approuvé par l’ABSL-2. Les équipements réutilisables, comme la balance, doivent être recouverts d’un film plastique pour éviter toute contamination.
4. Anesthésez avec 3 % d’isoflurane comme décrit ci-dessus. Pèse la souris et note le poids. Injecter la souris par voie sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préchauffé à 0,9 %, 250 μL sur chaque flanc, pour un total de 500 μL.
5. Si le film transparent de la souris s’est détaché pendant la nuit, retirez soigneusement toute croûte et appliquez un nouveau pansement.
6. Utilisez une seringue de 500 μL à tuberculine 27 G pour injecter 40 μL de suspension PAO1 :lux à travers le pansement transparent dans chaque plaie. Différentes souris doivent être utilisées pour les contrôles de plaies non inoculées/PBS afin d’éviter la contamination croisée du côté controlatéral.
7. Remettez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’elle se réveille. Toutes les souris doivent être logées individuellement dans des cages séparées pour éviter toute contamination croisée.
8. Fournissez une pâte de compléments nutritifs riche en calories entre des granulés alimentaires au sol de la cage.
9. Utilisez l’inoculum restant pour strier une plaque d’agar LB. Comptez les colonies pour confirmer le nombre de bactéries administrées.

6. Imagerie in vivo des plaies infectées

1. Suivez les protocoles de confinement BSL-2 pour le transport des souris vers et depuis l’instrument d’imagerie, y compris l’utilisation d’un contenant secondaire. Veillez à ne pas transférer ni ne laisser tomber de la litière animale lors du transfert de la souris vers la chambre d’induction ou l’instrument d’imagerie.
2. Induire l’anesthésie de la souris avec inhalation d’isoflurane à 1 % – 3 % dans une chambre d’induction.
3. Une fois la souris anesthésiée, placez-la en position prone dans la chambre d’imagerie d’un système optique d’imagerie, avec le nez dans le cône de nez en isoflurane.
4. Ouvre le logiciel.
5. Les paramètres d’acquisition varieront en fonction du nombre d’animaux photographiés simultanément et de l’intensité de la bioluminescence. Les paramètres de base à définir incluent le temps d’exposition, le binning, le f/stop et le champ de vision (FOV). Nos réglages de départ par défaut sont temps d’exposition 30 secondes, binning bas (2), f/stop 1,2 et FOV 25. Ajustez ces réglages selon les besoins du chercheur.
6. Analysez les données de luminescence à l’aide d’un programme d’imagerie. La luminescence sera représentée par une image pseudo-couleur superposée à une photographie couleur des souris.
   1. Créer une région d’intérêt (ROI) au site de la blessure et mesurer le flux moyen (photons/seconde) détecté. Notez que les données peuvent également être rapportées sous forme de radiance (photons/seconde/cm²/stéradien), mais tant que la distance de la plateforme d’imagerie par rapport à la caméra reste constante entre les images, le flux est suffisant.
   2. Mesurez le fond en créant un retour sur investissement dans une zone aléatoire sur la plateforme d’imagerie. Soustrayons le nombre de photons par seconde de fond.
   3. Exportez les données dans un tableau pour une analyse approfondie.
7. Effectuez des images comme décrit ci-dessus aussi souvent que par jour pour suivre la progression de l’infection.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Injection de chlorure de sodium à 0,9 %	Hospira	2484457
18 G x 1 aiguille stérile	BD	305195
25 G x 1 1/5 aiguille stérile	BD	305127
Prélèvement d’alcool	BD	326895
Logiciel d’imagerie d’aura	Imagerie des instruments spectraux	N/D
Betadine	Compagnie Purdue Frederick	19-065534
LABORATOIRE DE BUPRÉNORPHINE SR	Zoopharm	N/D
C57BL/6J mâles	Le laboratoire Jackson	664
Perforatrice jetable, 6 mm	Integra	33-36
Ciseaux fins - carbure de tungstène	Outils scientifiques finement	14568-09
Stérilisateur à billes de verre à sécher	Appareil de Harvard	61-0183
Agar granulé	Fisher BioReagents	BP9744
Bouillotte	Milliard	804879481218
Seringue à insuline avec aiguille de 28 g	BD	329461
Système d’imagerie Lago X	Imagerie des instruments spectraux	N/D
Bouillon LB	Fisher BioReagents	BP1426
Seringue Leur-Lok 1 mL	BD	309628
Mini Arco Coupe-Animaux	Wahl Professional	919152
Lotion dépilatoire Nair avec huile pour bébé	Church et Dwight	N/D	Disponible dans n’importe quelle pharmacie
Pinces octogonales	Outils scientifiques finement	11041-08
Boîte de Petri	Faucon	351029
Solution tamponnée phosphate (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Film plastique pressé et scellé	Content	N/D
Seringue à insuline SafetyGlide avec aiguille de 30 G	BD	305934
Seringue à insuline Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Échelle	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplément Supplément Nutritionnel	Henry Schein Santé Animale	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W