Isolement des bactéries à partir du milieu intestinal du moustique

Résumé

Source : Liu, X., et al. Un test oral bactérien avec des moustiques traités aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la dissection de l’intestin moyen du moustique pour isoler les bactéries intestinales. Le moyen de l’intestin est extrait du tube digestif, homogénéisé pour libérer les bactéries, puis placé sur de l’agar nutritif pour cultiver des colonies bactériennes.

Protocole

1. Disséquer le milieu intestinal du moustique
   1. Transférez le moustique stérilisé en surface sur la lame en verre avec une goutte de tampon stérile 1x phosphate tamponné (PBS). Disséquer sous le microscope de disséque.
   2. Sous le faible grossissement du microscope disséqueur, retirez soigneusement les pattes, ailes et la tête du moustique pour empêcher la fuite. Retirez le dernier somite du moustique en coupant directement, plutôt que tirant, pour éviter que le tube digestif ne se rompe.
   3. Pincez le thorax du moustique et l’extrémité de l’abdomen avec une pince. Retirez doucement le tube digestif du moustique. Le tube digestif acquis contient généralement la culture, l’intestin antérieur, l’intestin moyen, l’intestin postérieur et les trompes de Malpighi.
   4. Ajustez le microscope disséquant à un grossissement plus élevé. Retirez la culture, l’intestin antérieur, l’intestin postérieur et les tubes de Malpighi du tube digestif disséqué pour obtenir le milieu de l’intestin du moustique.
   5. Faites attention lors de l’enlèvement, car la culture se gonfle et ressemble au milieu de l’intestin après que le moustique ait pris une farine de sucre. Les tubes de Malpighi, un groupe de longs et fins tubes excrétors, se trouvent à la frontière entre l’intestin moyen et l’intestin postérieur.
2. Isoler les bactéries intestinales
   1. Transférez le milieu de l’intestin disséqué dans un tube stérile de 1,5 mL avec 200 μL de tampon PBS stérile 1x.
   2. Broyez soigneusement le milieu de l’intestin sur un établi stérile avec un pilon stérile pour permettre la libération complète des bactéries intestinales vers le tampon.
   3. Diluer en série l’homogénéat en trois dilutions de 10 fois. Ajoutez 50 μL de chaque dilution à l’assiette d’agar LB (bouillon Luria) et étalez-les sur la plaque. Si le milieu de l’intestin contient une forte concentration de flore intestinale, il est essentiel de produire davantage de dilutions en série pour identifier des colonies uniques.
   4. Incubez la plaque à 37 °C pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que des colonies uniques soient visibles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aedes aegypti			Moustiques femelles
Tube centrifugeuse	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 mL, Naturel, gradué, stérile
Pilon jetable à moudre en tissu	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm de long, conique, bleu, stérile
Pinces	Propulsion	F11029	Dissection
Poudre d’agar LB	Sangon Biotech	A507003	Tryptone 10,0 g, extrait de levure 5,0 g, NaCl 10,0 g, agar 15,0 g.
Microscope	Zeiss	Stemi508
Tampon PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Ce produit est une solution 10X. Veuillez diluer 10 fois avant utilisation. La valeur de pH est de 7,4.