Établissement d’une population bactérienne intestinale définie chez les moustiques adultes

Résumé

Source : Liu, X., et al. Un test oral bactérien avec des moustiques traités aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre l’appauvrissement du microbiote intestin naturel chez les moustiques à l’aide d’une solution contenant des antibiotiques en saccharose. Cela est suivi d’une recolonisation contrôlée avec une suspension bactérienne délivrée via un système d’alimentation membranaire afin d’établir une population bactérienne définie dans l’intestin du moustique.

Protocole

1. Traitement antibiotique et réintroduction des bactéries

1. Préparez la solution antibiotique.
   1. Peser la quantité requise de saccharole, pénicilline et streptomycine pour préparer une solution à 10 % de saccharose comprenant 20 unités de pénicilline et 20 μg de streptomycine par mL.
2. Nourrissez les moustiques avec la solution antibiotique.
   1. Anesthésiez les moustiques à 4 °C pendant 3 à 5 minutes. Transférez les moustiques dans un gobelet en papier. Couvrez le dessus de gaze et entourez la gaze avec du ruban adhésif pour empêcher les moustiques de s’échapper.
   2. Trempez des boules de coton stériles dans la solution antibiotique et placez-les soigneusement sur la coupelle anti-moustiques. Pressez les boules de coton avant les utiliser pour éviter que les moustiques ne se noient dans les boules de coton qui gouttent.
   3. Couvrez les boules de coton avec une boîte de Petri de 10 cm pour éviter l’évaporation de l’humidité. Remplacez les boules de coton deux fois par jour pendant trois jours consécutifs.
3. Préparation de la suspension bactérienne
4. Mesurez la solution bactérienne avec un spectrophotomètre. Ajoutez 1 suspension bactérienne OD (OD₆₀₀) dans un tube de 1 mL. Centrifugez la suspension à 5 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C.
5. Éliminez le surnageant et ajoutez 1 mL de tampon PBS stérile 1x à un tube de 1,5 mL pour la précipitation en suspension.
6. Centrifugeuse à 5 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C ; Jetez le surnageant.
7. Répétez les étapes 2.4.2 et 2.4.3.
8. Ajoutez 200 μL de tampon stérile de solution saline 1x tamponnée phosphate (PBS) à la précipitation bactérienne.
9. Ajoutez 600 μL de solution à 10 % de saccharose, 200 μL d’adénosine 5′-triphosphate (ATP) de 10 mm, qui agit comme phagostimulant, et 200 μL de suspension bactérienne dans un tube stérile de 1,5 mL. Mélange par vortex.
10. Nourrissez le moustique avec la suspension bactérienne.
    1. Affamez les moustiques pendant 24 heures, permettant aux antibiotiques de se métaboliser avant de nourrir les bactéries.
    2. Assemblez le système d’alimentation par membrane.
    3. Scellez l’unité d’alimentation stérilisée avec du parafilm ou, alternativement, une membrane de collagène.
    4. Mettez un anneau en plastique et fixez-le avec du parafilm pour éviter qu’il ne se casse à cause du frottement pendant l’alimentation.
    5. Ajoutez lentement la solution bactérienne préparée à l’unité de nourrissage.
       Note : Un seul puits de l’unité d’alimentation à deux puits peut être rempli avec la solution, et ne recouvre l’unité d’alimentation que du côté des chutes de réactifs.
    6. Connectez l’unité d’alimentation à un système d’alimentation préchauffé à 37 °C, qui simule la température humaine pour attirer les moustiques. Placez l’appareil d’alimentation sur un gobelet en papier rempli de moustiques et nourrissez pendant 90 minutes.
    7. Après l’alimentation, anesthésiez les moustiques en les soumettant à une température de 4 °C pendant 3 à 5 minutes et gardez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Petri glacée.
    8. Choisissez les moustiques complètement engagés pour des études complémentaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adénosine 5′-triphosphate hydrate de sel disodique	Sigma	A2383	L’adénosine 5′-triphosphate hydrate de sel disodique a été utilisée pour préparer des solutions standard d’adénosine triphosphate (ATP)
Système d’alimentation par membrane hémotek	Hemotek		Les composants du système d’alimentation, y compris le régulateur de température Hemotek, l’ensemble du logement d’alimentation, l’alimentation métallique ont été assemblés.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 pouces x 125 pieds
Boîte de Petri	Sangon Biotech	F611203
Sel de pénicilline G hydrate	Sangon Biotech	A606248	Poudre blanche. Soluble dans l’eau, soluble dans le méthanol, légèrement soluble dans l’eau, éthanol
Streptomycine sulfate	Sangon Biotech	A610494	Le sulfate de streptomycine est un antibiotique à base de glucosamine qui interfère avec la synthèse des protéines procaryotes.
Saccharose	Sangon Biotech	A502792	Soluble dans l’eau, l’éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le glycérol et la pyridine.
Tampon PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Ce produit est une solution 10X. Veuillez diluer 10 fois avant utilisation. La valeur de pH est de 7,4.