Imagerie en direct de la mort cellulaire des macrophages lors d’une infection mycobactérienne chez les embryons de poisson-zèbre

Résumé

Source : Niu, L., et al. Visualisation de la mort cellulaire lytique des macrophages lors d’une infection mycobactérienne chez les embryons de poisson-zèbre par microscopie intravitale. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie confocale intravitale pour visualiser la mort des cellules lytiques des macrophages chez les embryons de poisson-zèbre après une infection par Mycobacterium marinum .

Protocole

1. Imagerie en direct de l’infection

1. 1. Montage de poissons pour imagerie en conditions réelles
   1. Transférez jusqu’à 10 embryons anesthésiques à la tricaïne au centre d’un plat à fond en verre de 35 mm. Jetez le moyen E3 en surplus.
   2. Couvrez le plat d’agarose à 1 % à faible point de fusion et orientez soigneusement les embryons de poisson-zèbre à l’aide d’une aiguille de 10 G. Incubez le plat en verre sur de la glace pendant 10 secondes pour solidifier l’agarose.
      REMARQUE : Pour l’injection du mésencéphale, les embryons doivent être montés dans l’agarose avec la tête orientée vers le haut (Figure 1A).
   3. Une fois complètement solidifiée, couvrir l’agarose d’une couche d’eau d’œuf (plus 1 x tricaïne et PTU (N-phénylthiourée)).
2. Microscopie confocale à accéléré en temps à trois couleurs haute résolution
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont opérées sur une microscopie confocale équipée d’un objectif UV à huile 63,0x 1,40.
   1. Réglez la température de la chambre environnementale à 28,5 °C. Placez du papier mouillé à l’intérieur de la chambre pour fournir de l’humidité et éviter l’évaporation de l’eau de l’œuf.
   2. Placez le plat en verre de 35 mm avec le poisson-zèbre dans la chambre environnementale.
   3. Ouvre le logiciel de confocal et initialise l’étage. Passez à l’objectif UV d’huile 63,0 x 1,40 et localisez le poisson-zèbre en utilisant le canal champ clair avec un filtre à contraste d’interférence différentiel (DIC).
   4. Ouvrez la diode 405, l’argon (20 % de puissance) et le laser DPSS 561 nm. Configurez la puissance laser et les réglages de spectre appropriés.
      REMARQUE : Voici les réglages de spectre pour Céruléen (excitation = 405 nm ; émission = ~456–499 nm), eGFP (excitation = 488 nm ; émission = ~500–550 nm), DsRed2 (excitation = 561 nm ; émission = ~575–645 nm)
   5. Choisissez le mode d’acquisition « XYZ » « Sequential Scan » et réglez le format d’image sur « 512 x 512 pixels ».
   6. Passer en « mode données en direct ». Ciblez la position du premier poisson-zèbre et marquez la position « Début » et « Fin » Z. Répétez ce processus pour chacun des embryons restants. Une « Pause » peut être ajoutée à la fin du programme.
   7. Définissez la boucle et le cycle du programme.
   8. Sauvegardez le fichier.

Résultats

Figure 1 : Montage d’embryons de poisson-zèbre pour imagerie en direct. (A) Pour l’infection du mésencéphale, les embryons de poisson-zèbre étaient montés avec la tête orientée vers le bas. (B) Pour l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Un plat à fond en verre de 35 mm	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Microscope confocal	Leica	TCS SP5 II
Chambre Environnementale	Pecon	Contrôle de température 37-2 numérique
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-phénylthiourée (PTU)	Sigma	P7629