Évaluation in vitro de la destruction bactérienne par les phagocytes spléniques de souris chez les nouveau-nés

Résumé

Source : Seman, B. G., et.al. Modèle d’imagerie néonatale de septicémie bactérienne à Gram négatif. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’isolement des neutrophiles et des monocytes inflammatoires des rate de souris néonatales et leur application dans un test luminescent tuant les bactéries. Il couvre la dissociation mécanique, la lyse des globules rouges, l’enrichissement cellulaire à base de billes magnétiques, l’incubation bactérienne et la protection antibiotique. Les lectures de luminescence temporelle indiquent une internalisation initiale bactérienne suivie d’une élimination par le système immunitaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Test in vitro de tueur bactérienne

1. Retirez la rate d’un chiot nouveau-né non infecté et placez-la dans un panier en nylon de 40 μm à l’intérieur d’une boîte de Petri stérile de 60 mm. Répétez cela et concentrez les rates dans un seul tube pour être prélevées et homogénéisées ensemble.
2. Ajoutez 5 mL de solution séline phosphatée tamponnée (PBS) complétée avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 10 %.
3. Désagrégez le tissu à l’aide d’un piston à seringue stérile de 3 mL jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit créée.
4. Récupérez la suspension monocellule à l’extérieur du panier en nylon, transférez dans un tube centrifuge de 15 mL, puis faites des cellules à pellets à 350 x g pendant 5 minutes.
5. Suspendez les cellules dans un tampon de lyse des globules rouges (2 mL pour jusqu’à 7-8 rates) et laissez reposer 5 minutes à température ambiante pour éliminer les érythrocytes.
6. Lavez les splénocytes avec du PBS et des granulés comme ci-dessus.
7. Suspendre les splénocytes dans 0,25 mL de PBS complétés par 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA selon le rendement cellulaire attendu.
8. Comptez les splénocytes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une autre application appropriée.
9. Isoler les cellules Ly6B.2⁺ (population myéloïde de granulocytes/monocytes inflammatoires) avec des billes immunomagnétiques.
10. Semez les cellules Ly6B.2⁺ à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque noire ou blanche à 96 puits dans un volume de 0,1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS, 2 mM de glutamine et 25 mM de HEPES (milieu complet).
11. Énumérez E. coli bioluminescent et préparez l’inoculum bactérien à la multiplicité d’infection (MOI) désirée dans un volume final de 0,1 mL. Cela se fait mieux en fabriquant ce qui est nécessaire pour tous les puits dans un MOI commun en lot.
12. Ajoutez 0,1 mL d’inocule bactérien ou un milieu complet seul comme témoin. Incubez la plaque multi-puits à 37 °C et 5 % de_CO2 pendant 1 heure.
13. Remplacez le média par 0,2 mL de substrat complet frais contenant de la gentamicine (100 μg/mL) en retirant doucement le média avec une pipette et en ajoutant du substrat frais avec une nouvelle pointe de pipette. Ramenez la culture en incubation pendant 2 heures supplémentaires.
14. À 3 heures après l’infection, mesurez la luminescence dans chaque puits de la plaque de culture couverte depuis le fond à l’aide d’un lecteur de plaques, puis remettez la culture en incubation.
15. Répétez les mesures de luminescence à d’autres moments désirés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon de lyse ACK	Gibco	LSA1049201	Dosage de dégagement bactérien
Microperles Anti-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Isolation cellulaire
Escherichia coli O1 :K1 :H7-lux (exprime la luciférase)	N/A	N/A	Construit en interne à WVU
Tampon d’isolation	Miltenyi Biotec	N/A	Dosage de dégagement bactérien
LB Brow, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Croissance bactérienne
Passoire EASYstion (Panier en nylon)	Greiner Bio-one	542 040	Filtre cellulaire
SpectraMax iD3	Dispositifs moléculaires	N/A	Lecteur de plaques