Modéliser l’infection chez les souris néonatales à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées

Résumé

Source : Seman, B. G., et al. Un modèle d’imagerie néonatale de septicémie bactérienne à Gram négatif. J. Vis. Exp. (2020)

La vidéo présente un modèle murin néonatal pour étudier l’infection systémique à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées. Les nouveau-nés sont injectés avec des suspensions bactériennes à forte ou faible dose et sont renvoyés à leur mère pour des soins postnataux. Les bactéries encapsulées échappent à la détection immunitaire précoce, se propagent systémiquement et sont visualisées au fil du temps grâce à l’imagerie par luminescence. Ce modèle permet un suivi non invasif de la progression de l’infection chez les souris néonatales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de l’inoculum bactérien

1. Rayez une plaque d’agar de soja tryptique (TSA) avec une boucle inoculante pour isoler une colonie unique à partir d’un stock congelé d’Escherichia coli O1 :K1 :H7-lux qui exprime de manière stable la luciférase et présente une résistance à la kanamycine. Incubez toute la nuit à 37 °C.
2. Le lendemain, laissez le bouillon Luria (LB) atteindre la température ambiante (25 °C) dans un placard de biosécurité.
3. Sous une cagoule d’armoire de biosécurité, identifiez une colonie unique de la plaque striée et inoculez-la dans 3 mL de LB complétés à la kanamycine (30 μg/mL). Incubez toute la nuit à 37 °C avec un secouement à 220 tours par minute (tr/min). C’est la culture de départ.
4. Diluez la culture de démarrage à 1:100 dans un neuf 3 mL de LB sous une hotte d’armoire de biosécurité et remettez-la dans l’incubateur pendant 2-3 heures à 37 °C avec secouage (220 tr/min). C’est la culture de la stock.
5. Lisez la densité optique (OD) de la culture vierge et de la culture d’origine à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Ajouter 100 μL de LB (sans bactéries) dans un puits d’une plaque d’essai à fond plat de 96 puits ; C’est le blanc. Ensuite, ajoutez 100 μL de la culture d’origine à un puits séparé. Répétez pour deux répliques supplémentaires. L’absorption est mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques.
6. Soustrayons l’absorption à blanc de la valeur d’absorption de la culture stock (la valeur OD) et comparez à une courbe de croissance précédemment générée et validée pour déterminer une approximation de la densité bactérienne dans la culture de stock pour la préparation de la dose infectieuse.
7. Générez des inocula cibles en fonction de la question de recherche. Des inocules cibles de 2 unités de formation de colonies (CFU) de 2 x 10⁶ (faible) et de 7 x 10⁶ (hautes) par souris (/souris) ont été utilisées pour cette étude.
   1. Divisez la dose cible par souris (DoseT) par la concentration estimée de bactéries dans la culture de stock (Stock) afin d’obtenir le volume de bactéries nécessaire à partir du tube de stock (VS).
   2. Multipliez le VS par le nombre de souris (NM) à infecter, ainsi que suffisamment pour 5 à 10 surplus, pour la quantité totale de bactéries nécessaires à l’infection, plus 5 à 10 doses supplémentaires. Retirez ce volume du tube d’origine et ajoutez-le à un nouveau tube centrifugeuse.
   3. Utilisez l’équation ci-dessous : DoseT/Stock = VS x NM = volume total (VT) des bactéries à extraire du tube d’origine.
8. Centrifugez la bactérie à 2 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C et resuspendez la granule bactérienne dans 50 μL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) (pH 7,2-7,6) par solive à infecter (par exemple, pour 10 doses de 2 x 10⁶ bactéries par dose, la granule de 2 x 10⁷ bactéries serait resuspendue dans 500 μL de PBS). Encore une fois, il est recommandé de préparer plus d’inoculum que nécessaire. Préparez un volume égal de PBS uniquement pour les inoculations témoins. Maintenez l’inoculum infectieux et le contrôle du PBS sur glace jusqu’à l’infection.
9. Effectuer sept dilutions en série dix fois plus dans le PBS dans une plaque de dilution à fond plastique à 96 puits, et la plaque 25 μL des dilutions en double sur des plaques TSA en quadrants complétées par de kanmycine (30 μg/mL) pour énumérer la quantité réelle de bactéries administrées. Incuber à 37 °C toute la nuit pour la formation de la colonie avant l’énumération.

2. Identification animale

1. Organisez un nombre suffisant de couples reproducteurs afin que les portées puissent être synchronisées pour les chiots ayant un âge correspondant. Une variabilité d’âge de ± 1 jour est acceptable.
2. Identifier une femelle C57BL/6 enceinte et surveiller la naissance de la portée avant l’expérience prévue afin de déterminer précisément l’âge.
3. Pour distinguer les chiots témoins et infectés de 3 ou 4 jours, utilisez une paire de petits ciseaux à pointe fine en forme d’iris pour couper uniquement les extrémités des queues des petits témoins. Les chiots infectés ne reçoivent pas de coupe de queue. Avant de couper la queue, désinfectez la peau avec un coton arrosé de 70 % d’éthanol. Appliquez une pression sur l’extrémité de la queue avec un coton ou une gaze selon les besoins.
   REMARQUE : Cette procédure est réalisée sous une hotte d’armoire de biosécurité. Une coupe de queue d’environ 1/8 de pouce est suffisante.
4. Pour identifier les chiots des groupes témoins et infectés, utilisez une seringue d’insuline de 1 mL avec une aiguille permanente de 28 G x 1/2'' pour tatouer les queues des chiots. Avant de tatouer, désinfectez la peau avec un coton imbibé de 70 % d’éthanol. Cette procédure est réalisée sous une hotte d’armoire de biosécurité.
5. Pour tatouer la queue, appliquez de l’encre d’animal sur la pointe de l’aiguille. Ensuite, attachez soigneusement le chiot d’une main, la queue complètement exposée. Insérez doucement l’aiguille sous la peau, tout en gardant une profondeur superficielle, puis déplacez l’aiguille parallèlement à la peau de quelques millimètres jusqu’à ce qu’une petite marque, ou point, soit créée. Attendez quelques secondes avant de retirer lentement l’aiguille de sous la peau, pour éviter que l’excès d’encre ne soit libéré sous la peau.
6. Appliquez une pression sur la plaie avec un coton ou de la gaze selon les besoins. Enlevez l’excès d’encre de tatouage sur la surface de la peau avec 70 % d’éthanol.
7. Répétez ce processus avec les souris suivantes des groupes infectés et témoins, tout en ajoutant un point supplémentaire avec chaque petit tatoué (par exemple, le chiot 1 aura un point sur la queue, le chiot 2 en aura deux sur la queue, etc.).
   REMARQUE : Pour une couche supplémentaire d’identification, il est recommandé d’utiliser des couleurs distinctes d’encre de tatouage animal pour les groupes témoins et infectés.

3. Inoculation sous-scapulaire

REMARQUE : Pour cette étude, deux expériences ont été réalisées avec un groupe à faible dose et un groupe à haute dose désigné pour chaque expérience. Lors de la première expérience, 7 petits ont reçu l’inoculum à faible dose (4 petits ont été utilisés comme témoins), et 5 petits d’une portée séparée ont reçu la dose élevée (3 petits ont été utilisés comme témoins). Les petits de l’expérience 1 n’ont fourni des données que pour le point temporel de 24 heures. Dans la deuxième expérience, 8 chiots ont reçu l’inoculum à faible dose (2 petits ont été utilisés comme témoins), et 6 petits ont reçu l’inoculum à haute dose (2 petits ont été utilisés comme témoins). Les petits de l’expérience 2 ont fourni des données pour les moments de 0, 10 et 24 heures.

1. L’âge correspond des chiots ≤ 1 jour. Attribuez chaque portée à faible dose ou à haute dose. Dans une portée, assignez aléatoirement les petits comme groupes témoins ou infectés.
2. Au jour 3 ou 4 postnatal, notez le poids de tous les chiots avant l’inoculation avec E. coli-lux ou le témoin PBS. Séparez la mère des petits pendant cette période pour éviter qu’ils ne soient déplacés pendant l’infection.
3. Dans un cabinet de biosécurité à l’aide d’une aiguille d’insuline, aspirez soit le PBS, soit l’inocule d’E. coli-lux . Pour ce travail, des inocules de 2 x 10⁶ et 7 UFC de 10⁶ par souris ont été utilisés. Conservez à la fois l’inoculum infectieux et le PBS sur glace jusqu’à l’administration par injection sous-scapulaire.
4. Placez le nouveau-né sur une surface propre dans la capuche de l’armoire de biosécurité et soulevez la peau à la nuque comme pour le gratter.
5. Dans l’espace désormais créé entre la peau et le muscle de l’animal, insérez l’aiguille, remontez, juste sous la peau, et injectez 50 μL de PBS ou d’E. coli-lux. Libérez simultanément la partie de peau pincée pour éviter le reflux d’injection.
6. Retirez l’aiguille lentement et avec précaution. Remettez les chiots chez des mères après les injections. REMARQUE : En raison de leur stade anatomique dans le développement, il est techniquement difficile d’administrer une veine caudale ou une injection intrapéritonéale aux nouveau-nés aux nouveau-nés au jour 3-4. Ainsi, la voie de l’infection sous-scapulaire a été choisie pour cette étude en raison de la facilité d’exécution.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL de seringue d’insuline	Coviden	1188128012	Injection d’inoculum ou de PBS
Pâte à encre pour tatouages animaux	Ketchum	KI1482039	Identification animale
Pâte verte pour tatouages d’animaux	Ketchum	KI1471039	Identification animale
Escherichia coli O1 :K1 :H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1 :K1 :H7-lux (exprime la luciférase)	N/A	N/A	Construit en interne à WVU
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Agar de soja tryptique Difco	Becton, Dickinson and Company	236950	Croissance bactérienne
Logiciel IVIS Spectrum CT et Image vivante 4.5	Perkin Elmer	N/A	Imagerie intravitale
LB Brow, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Croissance bactérienne