Détection in situ de bactéries dans les sections de tissu gingival de souris

Source : Choi, Y. S., et al. Détection in situ de bactéries dans des tissus incorporés dans la paraffine à l’aide d’une sonde d’ADN marquée par digoxine ciblant l’ARNr 16S. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo démontre la détection in situ de bactéries dans des sections de tissu gingival de souris à l’aide de sondes d’ADN marquées par digoxine ciblant l’ADN bactérien. La section est incubée avec la sonde. Des anticorps conjugués à la phosphatase alcaline spécifiques à la digoxine sont ajoutés. Les phosphatases endogènes sont inactivées, et un précipité coloré est obtenu par ajout de substrat. La coupe est contre-colorée, déshydratée, nettoyée dans le xylène et montée avant la visualisation microscopique des bactéries.

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de la sonde

Amplification PCR de la sonde
1. Pour la sonde spécifique à Porphyromonas gingivalis, amplifiez un fragment d’ADN à 343 pb de l’ARNr 16S de P. gingivalis par PCR en utilisant l’ADN génomique de P. gingivalis et les amorces suivantes : 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' et 5' - ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Effectuer des amplifications avec les conditions de cycle suivantes : 35 cycles à 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s, et 72 °C pendant 1 min 20 s, suivis d’une extension de 5 minutes à 72 °C.
2. Amplifier la sonde eubactérienne à l’aide d’un fragment d’ADN à 70 pb (5'-CAGGTGCTGCATGGGTGTCGTCAGCTGTGTTGTGAAATGTTGTTAAGTCCCGCGCGCGCGCGCCCAACCCC-3') synthétisé en oligonucléotide et les amorces suivantes : 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' et 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Effectuez des amplifications avec les conditions de cycle suivantes : 40 cycles à 94°C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s, et 72 °C pendant 1 min 20 s, suivis d’une extension de 5 minutes à 72 °C.
3. Précipiter les produits PCR (≥500 μl) en ajoutant 3 M d’acétate de sodium (pH 5,2) et 100 % d’éthanol (au ratio 10:1:2) et en incubant à -20 °C pendant 2 heures.
4. Centrifugez le mélange à 14 000 x g pendant 15 minutes, résuspendez le pellet dans 100 μl d’acide tétraacétique Tris-éthylénédiamine (EDTA) ou tampon TE, et mesurez la concentration d’ADN par densité optique à 260 nm.
Marquage de la digoxigénine (DIG) à l’aide d’un kit de marquage et de détection ADN DIG
1. Mélangez 3 μg de la sonde avec de l’eau pour un volume final de 15 μl.
2. Dénature l’ADN à 95 °C pendant 10 minutes puis refroidis rapidement sur glace.
3. Ajoutez 2 μl de mélange hexanucléotidique 10x, 2 μl de mélange marquant le triphosphate désoxynucléoside (dNTP) et 1 μl d’enzyme Klenow à 15 μl de l’ADN dénaturé.
4. Mélangez et incubez à 37 °C pendant 24 h à 48 h, puis arrêtez la réaction en chauffant à 65 °C.
Vérifiez la sensibilité de la sonde marquée DIG à l’aide d’un kit de marquage et de détection ADN DIG
1. Chargez manuellement 1 μl de dilutions en série de la sonde de contrôle positive fournie dans le kit et 1 ng de la sonde marquée DIG sur la membrane en nylon et laissez sécher pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
2. Faites tremper brièvement la membrane dans 2x tampon saline-citrate de sodium (SSC) (0,3 M chlorure de sodium ou NaCl, 30 mM de citrate de sodium, pH 7,0) et incubez la membrane à 80 °C pendant 1 heure pour immobiliser l’ADN.
3. Faites tremper brièvement la membrane dans un tampon d’acide maléique (MAB, 0,1 M acide maléique, 0,15 M NaCl, pH 7,5) et incuber avec un anticorps conjugué à la phosphatase alcaline (AP) anti-DIG, dilué (1:5 000) dans 6 ml de solution bloqueante fournie dans le kit à RT pendant 30 minutes.
4. Lavez la membrane avec MABT (MAB contenant 1 % Tween 20) et appliquez 40 μl de la solution nitro-bleu tétrazolium/5-bromo-4-chloro-3'-indolylphosphate (NBT/BCIP) mélangée à 2 ml de tampon de détection (0,1 M tris(hydroxyméthél)aminométhane chlorhydrate ou Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M chlorure de magnésium ou_{MgCl 2}, pH 9,5) sur la membrane pendant 1 min. Si la sensibilité de la sonde étiquetée n’est pas satisfaisante, répétez les étapes de 1.1.3 à 1.3.4.
5. Mesurez la concentration d’ADN de la sonde marquée (OD₂₆₀) et ajustez la concentration à 100 ng μl-1.
Vérifiez la spécificité de la sonde marquée DIG
1. Dénaturez des échantillons d’ADN génomique (25 ng 3 μl-1 par échantillon) provenant de diverses espèces bactériennes, y compris la bactérie ciblée par la sonde spécifique, à 95 °C pendant 10 minutes, puis refroidissez rapidement sur la glace.
2. Chargez manuellement l’ADN dénaturé sur la membrane en nylon et laissez sécher pendant 20 minutes en RT.
3. Faites tremper brièvement la membrane dans deux tampons SSC et incubez la membrane à 80 °C pendant 2 heures pour immobiliser l’ADN.
4. Bloquez la membrane avec une solution bloquante à la RT pendant 1 heure.
5. Diluez la sonde à 1 ng μl-1 dans un tampon d’hybridation, dénaturez les sondes diluées, puis appliquez-les sur la membrane.
6. Incubez la membrane à 45 °C pendant 1 heure.
7. Lavez la membrane trois fois avec deux tampons SSC.
8. Trempez brièvement la membrane dans le MAB.
9. Incuber avec un anticorps conjugué anti-DIG AP dilué (1:2 000) dans 6 ml de solution bloqueante à RT pendant 1 heure.
10. Lavez la membrane avec du MABT et appliquez 40 μl de solution NBT/BCIP mélangée à 2 ml de tampon de détection.
11. Lorsque la sonde n’atteint pas la spécificité attendue, on augmente la température d’hybridation jusqu’à ce que la spécificité soit observée.

2. Hybridation in situ

Remarque : Pour éviter le séchage des spécimens et des réactifs, effectuez toutes les incubations dans une chambre humidifiée doublée de papier essuie-tout humide.

Déparaffinisation et réhydratation des coupes tissulaires
1. Préparez des sections de tissu de 4 μm d’épaisseur à partir de blocs incrustés dans la paraffine. Le formol, le paraformaldéhyde et le fixateur à base de zinc sont compatibles avec ce protocole.
2. Préparez tous les réactifs à l’aide d’eau traitée au pyrocarbonate diéthylique (DEPC).
3. La chauffe est laissée chauffer dans un four sec à 60 °C pendant 30 minutes et les lames d’incubation à RT pendant 30 minutes.
4. Immergez les lames dans du xylène à 100 % pendant 5 minutes trois fois ; Utilisez du xylène frais à chaque fois.
  Note : Effectuez cette procédure de décirage dans une hotte chimique.
5. Immergez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 minutes deux fois, en utilisant de l’éthanol frais à chaque fois, et réhydratez les échantillons en solution de série à 90 %, 80 % et 70 % d’éthanol pendant 5 minutes chacun.
6. Immergez les lames dans de l’eau traitée au DEPC pendant 1 minute et les lames de lavage dans du sérum tampon phosphate traité par DEPC ou du PBS (pH 7,4) pendant 6 minutes.
Prétraitements des coupes tissulaires
1. Immergez les lames dans de l’acide chlorhydrique à 0,1 N pendant 20 minutes et lavez les lames dans de l’eau traitée par DEPC pendant 30 s.
2. Dessinez une barrière hydrophobe autour des spécimens à l’aide d’un stylo à cire.
  Note : La taille de la barrière hydrophobe dépend de la taille des sémiciers. Ainsi, les volumes de réactifs utilisés dans les étapes suivantes varient en fonction de la taille des échantillons mais doivent remplir la barrière hydrophobe (50 μl pour les petits échantillons et 400 μl pour les gros échantillons).
3. Traiter les échantillons avec 50 à 400 μl de protéinase K (1 à 10 μg ^ml-1 dans un PBS traité au DEPC) dans un four sec à 37 °C pendant 30 minutes et laver les lames dans 1x PBS traité par DEPC pendant 1 minute.
4. Faire tremper les lames dans du paraformoldéhyde à 4 % dans du PBS traité au DEPC pendant 10 minutes, puis laver les lames dans du PBS traité au DEPC pendant 1 minute.
5. Faire tremper les lames dans 0,1 M de triéthananolamine-HCl (pH 8,0) contenant 0,5 % d’anhydride acétique pendant 20 minutes et laver les lames dans de l’eau traitée par DEPC pendant 30 secondes.
Hybridation avec la sonde et lavage
1. Immergez les diapositives dans 2x SSC buffer pendant 20 minutes.
2. Diluez la sonde à 1 ng ^μl-1 dans un tampon d’hybridation (4x SSC, formamide à 50 % [vol/vol], 1 x solution de Denhardt, sulfate de dextran à 10 % [en poid/vol], 0,1 % [en poid/vol] dodécyle sulfate de sodium, 0,4 mg d’ADN de spermatozoïde de saumon ml-1). Pour les contrôles négatifs, mélangez la sonde étiquetée avec une quantité excédentaire de sonde non marquée de 10 fois.
3. Dénaturez les sondes diluées et appliquez 50 à 400 μl sur les sections tissulaires. Placez un couvercle sur la culasse et scellez-la avec du vernis à ongles.
4. La chaleur est déposée dans la machine PCR à 90 °C pendant 10 minutes et incube les lames dans une chambre humidifiée toute la nuit (O/N) à 45 °C ou à la température optimale déterminée à l’étape 1.4.11.
5. Refroidissez les lames à 4 °C pendant 30 minutes, retirez les couvercles et immergez les lames dans un tampon SSC série comme suit : 4 SSC pendant 10 minutes, préchauffés (45 °C), 2x SSC pendant 20 minutes, 2x SSC pendant 10 min et 0,2x SSC pendant 10 min.
Détection par anticorps conjugué AP anti-DIG
1. Laver les lames en MABT pendant 5 minutes.
2. Bloquez avec 50 à 400 μl de solution bloqueante avec 1 % de Tween 20 pendant 20 minutes.
3. Ajoutez 50 à 400 μl d’anticorps anti-DIG-AP dilué dans une solution bloqueante (1:1 000) et éclovez à 37 °C pendant 90 minutes.
4. Laver les lames en MABT pendant 10 minutes.
5. Immergez les diapositives dans un tampon de détection contenant 1 % Tween 20 pendant 5 minutes.
6. Traiter avec 50 à 400 μl de 1 mM de léamisole (dans un tampon de détection contenant 1 % Tween 20) pendant 5 minutes pour inactiver la phosphatase alcaline endogène.
7. Distribuez 50 à 400 μl de la solution NBT/BCIP prémélangée (diluée dans un tampon de détection à 1:100) sur chaque échantillon et incubez les lames dans une chambre humidifiée à RT pendant 2 à 3 heures jusqu’à ce que le signal développé soit satisfaisant.
8. Rincez les lames à l’eau désionisée pour arrêter la visualisation et appliquez 50 à 400 μl de vert méthyle à 0,05 % [en poid/vol] comme contre-teinture à 37 °C pendant 10 minutes.
9. Rincez les lames avec de l’eau déionisée, déshydratez-les à 100 % d’éthanol, puis immergez-les dans du xylène.
10. Appliquez 80 μl de solution de montage sur chaque culasse et couvercle avec des coulisses.

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Anhydride acétique	Sigma	6404
Solution de sulfate de Dextrane à 50 %	Millipore	S4030
La solution de 50X Denhardt	Sigma	D2532
Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)	Sigma	P159220
Kit de marquage et de détection de l’ADN digoxigénine (DIG)	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
Stylo ImmEdge™	Dako	H-400
Levamisole	Vecteur	SP-5000
Chlorure de magnésium	Sigma	246964
Acide maléique	Sigma	M0375
Vert méthyl	Sigma	M6776
Paraformélélidoïde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Solution d’ADN de sperme de saumon	Invitrogen	#15632-011
Chlorure de sodium	Sigma	S9625
Citrate de sodium	Duksan	D1420
Dodécyle sulfate de sodium	Amresco	227
Triéthananolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Organiques de recherche	3098T

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