Visualisation de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Abstract

Source : Luyts, N., et al. Suivi longitudinal des infections urinaires et leur traitement chez la souris par imagerie bioluminescente. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre l’induction et le suivi de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant l’E. coli bioluminescente injectée dans la vessie, où se produisent l’adhésion, l’invasion et la réplication intracellulaire bactérienne. La lumière émise par l’opéron bioluminescent sert de marqueur en temps réel de la charge bactérienne lors de la progression de l’infection.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation des animaux

1. Préparation des animaux
   1. Choisissez la ou les souches de souris souhaitées en fonction de la question de recherche et de la disponibilité des lignées de dégradation, des détails expérimentaux et des différences de sensibilité aux infections urinaires. Gardez à l’esprit que la cathétérisation transurétrale est plus facile chez les souris femelles. N’utilisez pas d’animaux de moins de 8 semaines, car ils sont immunologiquement immatures. Ici, des souris femelles C57Bl/6J de 12 semaines ont été utilisées.
   2. Commandez les animaux bien à l’avance et laissez-les s’acclimater, idéalement pendant 7 jours. Hébergez les animaux en groupe dans des cages ventilées individuellement, dans des conditions standard de 12 heures de lumière et d’obscurité.
   3. Rasez la région abdominale des animaux pour limiter la perte de signal. N’utilisez pas de crème dépilatoire, car elle peut brûler rapidement la peau des animaux. Immobilisez l’animal en tenant fermement la peau du cou et les membres postérieurs avec la main non dominante tout en se rasant avec la main dominante. Sinon, raser sous anesthésie isoflurane.
      REMARQUE : Les animaux ont été rasés deux jours avant l’imagerie, car ils vont encore mieux toiletter la zone rasée.
   4. Fournissez de l’eau et de la nourriture standard à volonté tout au long de l’expérience. Cependant, privez les animaux d’eau 2 heures avant l’instillation afin de minimiser le volume vésique pendant l’instillation.
   5. Montez une embout stérile d’angiocathéter de 24 G sur une seringue de 100 μL et remplissez la seringue avec la solution bactérienne.
      REMARQUE : Pour déterminer la luminescence de fond, obtenez une image de base avant l’installation (voir étape 2, ci-dessous).
2. Installation des animaux
   1. Placez les animaux dans une chambre d’induction et anesthésiez-les en inhalant de l’isoflurane avec de l’oxygène pur comme gaz porteur (induction à 3 % et entretien à 1,5 %).
   2. Placez un animal sur une surface de travail en position couchée et maintenez une anesthésie isoflurane stable à l’aide d’un cône de nez pendant l’instillation. Appliquez la pommade pour les yeux.
   3. Expulsez l’urine résiduelle en appliquant une compression douce et en effectuant des mouvements circulaires sur la région suprapubienne. Nettoyez le bas de l’abdomen avec 70 % d’éthanol avant l’insomnation.
   4. Lubrifie la pointe du cathéter avec du sérum physiologique normal. Posez l’index de la main non dominante sur l’abdomen et poussez-le doucement vers le haut. Commencez la cathétérisation de l’urètre à un angle de 90° (verticalement) et, une fois la résistance rencontrée, inclinez-la horizontalement avant de l’insérer davantage (0,5 cm).
      REMARQUE : Ne poussez jamais de force sur le cathéter, car cela pourrait endommager l’urètre. Des mouvements de rotation doux peuvent être utiles lors de la pose d’un cathéter. En revanche, un manque de résistance indique généralement une insertion erronée dans le vagin.
   5. Effectuer une instillation lente (5 μL/s) de 50 μL de l’inoculum bactérien (2 x 10⁷ UFC).
      REMARQUE : Des volumes plus élevés ou une insomnation plus rapide peuvent provoquer un reflux vers les reins. Lors de la pratique de la technique, l’encre bleue peut être utilisée pour évaluer le reflux.
   6. Après l’installation, maintenez la seringue et le cathéter en place encore quelques secondes, puis rétractez-les lentement pour éviter toute fuite. Notez toute irrégularité telle qu’une forte fuite ou un méat sanglant et excluez les animaux, si nécessaire.
   7. Placez l’animal en position couchée au niveau du cône du nez de la chambre d’imagerie et répétez les étapes précédentes 1.1.1-1.1.6 pour tous les animaux restants. Utilisez un cathéter par groupe expérimental. Veillez à ce que l’anesthésie soit poursuivie et minimisez le temps entre le premier et le dernier animal.
   8. Si nécessaire, administrez des antibiotiques ou des médicaments expérimentaux avant ou après l’imagerie (étape 2). Par exemple, pour administrer de l’enrofloxacine, ajoutez 40 μL de solution d’enrofloxacine (100 mg/mL) à 3,96 mL de solution physiologique pour obtenir une dilution de 1/100. Injectez 100 μL/10 g par voie sous-cutanée à 9h et 17h pour administrer 10 mg/kg d’enrofloxacine deux fois par jour pendant 3 jours.

2. Imagerie par bioluminescence

1. Préparation et sélection des paramètres d’imagerie
   1. Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI (voir Table of Materials) et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie (voir Table of Materials) pour tester la caméra et le système de contrôle de scène et pour refroidir la caméra CCD à -90 °C.
      REMARQUE : Pendant ce processus, la porte est verrouillée et l’avancement de l’initialisation peut être suivi sur le panneau de contrôle. Une lumière verte indique que la température de -90 °C a été atteinte. Un avertissement apparaîtra si l’imagerie est tentée avant la fin de l’initialisation.
   2. Assurez-vous que les données sont enregistrées automatiquement : cliquez sur Sauvegarde automatique d’acquisition et sélectionnez le bon dossier.
   3. Sélectionnez la luminescence et photographiez-la. Vérifiez les réglages de luminescence par défaut : Réglez le filtre d’excitation sur Bloc et le filtre d’émission sur Ouvert.
   4. Réglez le temps d’exposition sur Auto lors de la première photo, surtout en attendant un signal faible, afin d’assurer un nombre suffisant de photons. Pour les mesures in vivo et les signaux lumineux, réglez le temps d’exposition à ~30 s. Si l’image est saturée, un avertissement apparaîtra. Si cela arrive, réduisez le temps d’exposition.
   5. Sélectionnez le Binning moyen, F/stop 1, et choisissez le champ de vision (FOV) correct (D pour 5 animaux).
   6. Réglez la hauteur du sujet à 1 cm lors de l’imagerie des souris.
   7. Cliquez trois fois sur Ajouter dans le panneau de contrôle d’acquisition pour obtenir une séquence de trois images, au fur et à mesure que les répliques techniques.
2. Imagerie
   1. Placez les souris dans la chambre d’imagerie en position couchée et utilisez le cône nasal variateur pour maintenir l’anesthésie (isoflurane 1,5 %) tout au long de l’expérience. Imagez jusqu’à 5 souris simultanément et séparez les animaux à l’aide du déflecteur lumineux pour éviter la réflexion.
   2. Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour lancer la séquence d’imagerie.
   3. Remplissez des informations détaillées sur l’expérience (animaux sauvages et knockout, traitements, jour de l’imagerie, etc.). Les réglages d’imagerie, comme le temps d’exposition, sont enregistrés automatiquement.
   4. Retirez les souris de la chambre d’imagerie et remettez-les dans leur cage. Vérifiez la récupération complète après anesthésie. En quelques minutes, les animaux devraient être pleinement éveillés et explorateurs. Ne prescrivez pas d’analgésique car cela pourrait interférer avec l’évolution de l’infection urinaire.
   5. Remet les cages dans les supports ventilés jusqu’au prochain cycle d’imagerie. Après l’achèvement de l’expérience, euthanasiez les animaux par asphyxie au CO₂ ou par luxation cervicale. Faites cela avant la récupération de l’anesthésie à l’isoflurane pour minimiser la détresse

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vaporisateur d’anesthésie	Harvard Apparatus Limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacine
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Angiocathère jaune, utilisez une embout en plastique stérile pour l’inconditionnement
C57Bl/6J	Janvier	N/A
Centrifugeuse 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinéen	pour mesurer OD 600nm
Solution au phosphate tamponnée de Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Éthanol 70 % dénaturé 5L	VWR international	85825360
Tube en polystyrène à fond rond Falcon 14 ml, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50 ml de démarrage cellulaire	Greiner	227285
Seringue Hamilton GASTIGHT, verrouillage PTFE Luer, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	pour assurer une instillation bactérienne lente de 50 μL
Boucle d’inoculation	Roth	6174.1	détenteur : Art. N° 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Produits Dechra Veterinary	N/A	Isoflurane
Système d’imagerie in vivo du spectre IVIS	PerkinElmer	REF 124262	Dispositif d’imagerie