Préparation de la culture d’Agrobacterium pour la délivrance de gènes dans les cellules végétales

Résumé

Source : Shi, J., et al., Dépistage et identification des suppresseurs de silencieux d’ARN à partir des effecteurs sécrétés de pathogènes végétaux. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la procédure de préparation d’une culture d’Agrobacterium tumefaciens en induisant l’expression génique de virulence avec de l’acétosyringone, suivie d’un retrait antibiotique par lavage et resuspension, afin de générer une suspension prête à la transformation destinée à la transmission des gènes dans les tissus végétaux.

Protocole

1. Préparation de la culture d’Agrobacterium pour l’infiltration

1. Prélevez une colonie positive sur la plaque Luria-Bertani (LB) et inoculez les cellules dans un tube en verre contenant 5 mL de milieu LB complétés avec 50 μg/mL de kanmycine et 50 μg/mL de rifampicine. Faites croître les cellules à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min pendant 24−48 heures.
2. Transférer 100 μL de culture dans 5 mL de milieu LB complété avec les mêmes antibiotiques, 10 mM d’acide éthanasylonique 2-(N-morpholino) (MES ; pH 5,6) et 20 μM acétosyringone (AS). Faites pousser les bactéries à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min pendant 16−20 heures.
3. Centrifugez les cellules à 4 000 x g pendant 10 minutes. Versez le surnageant et resuspendez la pellete dans 2 mL de tampon_{MgCl 2} de 10 mM.
4. Répétez l’étape 1.3 pour assurer le retrait complet des antibiotiques.
5. Déterminez la densité de la culture d’Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀). Ajustez à un OD₆₀₀ de 1,5−2,0 avec un tampon_{MgCl 2} de 10 mM.
6. Ajouter 10 mM de MES (pH 5,6) et 150 μM d’AS aux cultures en suspension finale et incuber les cellules à RT pendant au moins 3 heures sans secousses.
   REMARQUE : Ne laissez pas les cultures de suspension finale toute la nuit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 2-morpholinoéthansulfonique (MES)	Biofroxx	1086GR500	Tampon
Acétosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction d’Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Extraction de levure bacto	BD Biosciences	212750	LB medium
Sulfate de kanamycine	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotiques
Rifampicine	MP Biomédicals	219549005	Antibiotiques
Chlorure de sodium	Amresco	0241-10KG	LB medium