Préparation du tissu de vessie de souris pour la visualisation d’une infection bactérienne

Abstract

Source : O’Brien, V. P., et al., Infection urinaire récurrente d’Escherichia coli déclenchée par l’exposition à la vessie vaginale à Gardnerella vaginalis chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie électronique à balayage pour visualiser la colonisation bactérienne et les interactions hôte-pathogène dans l’épithélium de la vessie d’un modèle murin pré-infecté.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Imagerie des vessies par microscopie électronique à balayage

   REMARQUE : Cette procédure peut être réalisée à tout moment où la visualisation de l’urothélium est souhaitée. Comme indiqué dans la Figure 1 (boîtes violettes), les interactions uropathogènes entre E. coli (UPEC) et urothéliaux sont mieux visualisées entre 6 h et 24 h après l’inoculation UPEC lors de la phase de formation du réservoir, et l’exfoliation urothéliale déclenchée par Gardnerella vaginalis est mieux visualisée entre 3 h et 12 h après la seconde exposition à G. vaginalis .

   1. Fixation vessique in situ
      1. Préparez le fixateur immédiatement avant la récolte de la vessie en ajoutant du glutaraldéhyde (2,5 % final) et du paraformoldéhyde (2 % final) dans un tampon de cacodylate sodique à 0,15 M avec 2 mM de_{CaCl 2} au pH 7,4. Utilisez du paraformaldéhyde et du glutaraldéhyde provenant d’ampoules de verre nouvellement ouverts, car les deux fixateurs s’oxydent avec le temps dans des contenants ouverts. ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique, irritant respiratoire et corrosif ; Le paraformoldéhyde est inflammable, cancérigène, un irritant et une toxine reproductrice ; Le cacodylate de sodium est toxique et cancérigène.
      2. Pour obtenir 50 mL de solution fixative, ajoutez 6,25 mL de paraformoldéhyde à 16 %, 2 mL de glutaraldéhyde à 50 % et 16,75 mL d’eau ultrapure à 25 mL d’une solution de cacodylate de sodium à 0,3 M au pH 7,4 avec 4 mM de_{CaCl 2}.
      3. Réchauffez le fixateur préparé à 37 °C avant de l’administrer aux vessies.
      4. Remplir la seringue à pointe à tuberculine avec un fixateur et fixer un cathéter à l’extrémité, biseau face aux marques opposées de la seringue. Coupez l’excès de tube à 1 à 2 mm de l’extrémité de l’aiguille, en faisant attention à ne pas exposer la pointe de l’aiguille. Faites un coup de seringue pour enlever les bulles et poussez le piston pour évacuer l’air et remplissez le cathéter de fixatif sur un tube de microcentrifuge pour collecter tout fixateur afin de le jeter correctement.
      5. Anesthésiez et sacrifiez la souris selon une méthode approuvée (par exemple, une luxation cervicale sous anesthésie). Placez la souris sur la surface de dissection avec les jambes fixées (avec des élastiques ou des goupilles). Ouvrez la zone pelvienne de la souris avec des pinces et une paire de ciseaux chirurgicaux pour exposer la vessie. Écartez doucement la graisse adjacente mais laissez la vessie en place.
      6. Tiens la seringue avec la main dominante, l’aiguille pointant vers le bas et les marquages de biseau et de seringue tournés à l’opposé de toi. Trempez la pointe du cathéter dans un lubrifiant stérile.
      7. Positionnez la pointe du cathéter à l’ouverture urétrale, en tenant le canon de la seringue à l’écart à un angle de 30 à 45° au-dessus du corps de la souris.
      8. Appliquez une pression vers le bas en effectuant un mouvement très léger dans le sens horaire avec la pointe et insérez doucement le cathéter dans l’urètre. Lorsque la pointe du cathéter entre dans l’urètre, inclinez la seringue vers la queue de la souris tout en continuant à glisser le cathéter plus loin dans l’urètre jusqu’à ce que le canon de la seringue soit parallèle à la surface de travail. L’ensemble de la tige de l’aiguille du cathéter (hors base) doit entrer dans la souris, positionnant la pointe du cathéter dans la lumière de la vessie.
      9. Administrez lentement 50 à 80 μL de fixateur, ce qui fait gonfler la vessie comme un ballon. Maintenez le cathéter en place et relevez légèrement la seringue en inclinant la pointe vers le haut.
      10. De l’autre main, ouvrez un hématonte et glissez une pointe sous l’aiguille du cathéter à l’intersection de l’urètre. Fermez partiellement l’hémosat jusqu’à ce qu’il touche juste l’aiguille.
      11. Faites doucement glisser l’aiguille du cathéter hors de la vessie tout en serrant et verrouillant complètement l’hémostat pour éviter la perte du fixateur.
      12. Saisir l’hémostat de façon à ce qu’il soit parallèle à la surface de travail, avec la vessie posée dessus. Soulevez doucement et délicatement coupez sous l’hémostatique (côté opposé de la vessie) pour retirer la vessie avec l’hémostrat toujours attaché.
      13. Placez la vessie et l’hémostat attaché dans un tube Falcon contenant un fixateur chauffé. Assurez-vous que la vessie est complètement immergée dans le liquide et ne soit pas pressée contre les parois du tube. Incuber à 4 °C pendant 24 heures.
   2. Traitement et imagerie de la vessie avec microscopie électronique à balayage (MEB)
      1. Coupez la vessie en deux sagittalement avec une lame de rasoir nettoyée à double face, puis effectuez une seconde coupe tangentielle à l’hémostat pour libérer la vessie. Cela donne 2 « coupes » à demi-vessie. S’il reste des coussinets graisseux à l’extérieur de la vessie, retirez-les doucement.
      2. Rincez les moitiés de la vessie trois fois (10 min chacune) dans un tampon cacodylate de sodium (0,15 M, pH 7,4).
      3. Colorez le tissu avec du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon cacodylate de 0,15 M pendant 1 h à température ambiante. L’osmium est sensible à la lumière ; Par conséquent, effectuez cette étape avec le récipient de teinture enveloppé dans du papier aluminium pour maintenir un environnement sombre. ​
         ATTENTION : Le tétroxyde d’osmium est toxique et corrosif pour la peau. Faites cette étape dans la hotte à fumée avec des gants.
      4. Rincez les moitiés de la vessie trois fois (10 min chacune) dans de l’eau ultrapure. Pendant ces étapes, de l’huile osmicée peut parfois être vue à la surface de l’eau. Aspirez ou évacuez cette chaleur pour éviter toute contamination lors des étapes de séchage.
      5. Déshydratez les tissus en les immergeant dans une série d’éthanol graduée (50, 70, 90, 100 et 100 %) pendant 10 minutes chacun.
      6. Séchez le tissu fixe à l’aide d’un séchoir à point critique, en effectuant des échanges de 12 CO₂ à la vitesse la plus lente. Réglez tous les réglages supplémentaires sur lent, sauf l’étape de ventilation, qui est réglée sur rapide.
      7. Coupez chaque moitié de vessie à nouveau avec un rasoir propre à double face pour générer un total de 4 morceaux afin de réduire la courbure de l’échantillon pour un revêtement plus efficace, faciliter l’imagerie dans le MEB, et exposer les tissus qui ont pu se recourber lors du séchage.
      8. Fixez les morceaux de la vessie à une languette adhésive au carbone conductrice sur un bout d’aluminium et peignez une petite quantité d’adhésif argenté autour du contact du bas avec un cure-dent, en veillant à empêcher l’excès d’adhésif de s’évacuer sur la surface interne de la vessie.
      9. Utilisez un revêtement à spitter sous vide élevé pour recouvrir les morceaux d’échantillon avec 6 nm d’iridium. Si les échantillons continuent de charger, assurez-vous qu’un passage conducteur est peint vers la surface avec de la peinture argentée et revêtez 4 nm supplémentaires d’iridium.
      10. Imagez les échantillons avec un microscope électronique à balayage. Bien que les conditions puissent varier selon le microscope utilisé, une tension d’accélération de 3 KeV avec un courant de faisceau de 200 pA et une distance de travail de 12-13 mm fonctionnait bien sur un Zeiss Merlin FE-SEM lors de l’utilisation du détecteur d’électrons Everhart-Thornley (SE2).

Results

Figure 1. Schéma du modèle souris. La chronologie est mise en évidence pour refléter les phases ou procédures du modèle décrites dans le protocole. Phase 1 (orange) : Établissement des réservoirs intracellulaires d’E. coli uropathogè...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 aiguilles	BD	305106	Pour les cathéters
Hémostat à pince droite de 5 1/2"	McKesson	487377	Fixation vessique in situ
Coater sputter ACE 600	Leica		Traitement des échantillons SEM
Étalon de MEB en aluminium	Ted Pella	16111	Traitement des échantillons SEM
Chlorure de calcium	EMS	12340	Fixation vessique in situ
Languette adhésive conductrice au carbone	Ted Pella	16084-1	Traitement des échantillons SEM
Peinture argentée conductrice	Ted Pella	16034	Traitement des échantillons SEM
Sécheuse à point critique CPD 300	Leica		Traitement des échantillons SEM
Clip métallique à cytoentonnoir	Simport	M964B	Analyse d’urine cytospune
Éthanol	EMS	15050	Traitement des échantillons SEM
Glucose	Sigma	G7528	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Glutaraldéhyde	EMS	16320	Fixation vessique in situ
Kit de teinture Hema 3	Fisher	23123869	Cytospun urinaire
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Iridium	Ted Pella	91120	Traitement des échantillons SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Microscope électronique à balayage
Purificateur d’eau Milli-Q	Millipore	IQ-7000	Traitement des échantillons SEM
Tétraoxyde d’osmium	EMS	19170	Traitement des échantillons SEM
Paraformélélidoïde	EMS	15710	Fixation vessique in situ
Tubulure en polyéthylène	Intramédic	427401	pour les cathéters
Peptone Protéose #3	Fisher	DF-122-17-4	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Lame de rasoir à double tranchant revêtue de PTFE	EMS	72000	Pourcoupe des vessies pour le MEB