Isolement et culture de bactéries à partir d’embryons de poisson-zèbre pour évaluer la charge infective

Résumé

Source : Bernut, A., et al., Déchiffrer et imager la pathogenèse et le cordon de Mycobacterium abscessus chez les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo démontre un protocole pour isoler et quantifier Mycobacterium abscessus à partir d’un embryon de poisson-zèbre infecté. La procédure consiste en l’euthanasie de l’embryon, la lyse tissulaire et l’homogénéisation pour libérer les bactéries, suivies de centrifugation et de resuspension dans un tampon de tensioactif. Enfin, la suspension bactérienne est diluée en série, placée sur de l’agar supplémenté en antibiotiques, puis incubée pour permettre la formation et la quantification des colonies.

Protocole

1. Préparation et stockage de l’inoculum de M. abscessus
   1. Conditions de croissance de M. abcès
      1. Évacuez M. abcès d’un stock de glycérol à -80°C sur une agar Middlebrook 7H10 contenant 10 % d’OADC et 0,5 % de glycérol (7H10OADc), complétée par l’antibiotique approprié selon le marqueur de résistance porté par le vecteur codant la protéine fluorescente. Incubez les plaques à 30 °C pendant 4 à 5 jours.
      2. Prenez une colonie mycobactérienne fluorescente positive et inoculez 1 ml de bouillon Middlebrook 7H9 complété avec de l’OADC, 0,2 % de glycérol, 0,05 % de préadolescents 80 (7H9OADc/T) avec l’antibiotique nécessaire dans un tube plastique stérile de 15 ml. Incubez à 30 °C pendant une semaine sans secousses.
         REMARQUE : Tween 80 limite les agglutinements et l’agrégation bactérienne.
      3. Resuspendez la pré-culture obtenue en 2,1,2 dans 50 ml de Middlebrook 7H9OADc/T dans des flasques de culture tissulaire de 150 cm2 jusqu’à un OD_{final de 0,1 (} correspondant à environ 5,107 bactéries/ml) et incubez davantage à 30 °C pendant 4 jours pour obtenir une culture à croissance exponentielle (_{DO 600} = 0,6 à 0,8).
         REMARQUE : Pour minimiser les agglutinements, surtout de la variante rugueuse, l’incubation ne doit pas dépasser 5 jours. Les variantes lisses et rugueuses affichent un taux de croissance similaire.
2. Préparation de l’inocula de M. abscessus
   REMARQUE : En raison de la forte propension de l’abcès de M . rugueux à former de gros agrégats et à produire des cordons, un traitement spécifique est nécessaire pour générer des inocules homogènes et contrôlés quantitativement avant les microinjections dans les embryons. Ce traitement est également appliqué aux bactéries lisses qui produisent des agrégats, bien que dans une moindre mesure que la souche rugueuse.
   1. Récolter des cultures à croissance exponentielle à partir de flacons de culture tissulaire de 150 cm2 par centrifugation à 4 000 x g pendant 15 minutes à RT dans un tube plastique stérile de 50 ml, puis resuspendre le granule bactérien dans 1 ml de 7H9OADc/T. Une aliquote de 200 μl de suspensions bactériennes dans des tubes microcentrifuges de 1,5 ml.
      REMARQUE : Travailler avec de petits volumes dans des seringues de 1 ml est nécessaire pour obtenir des suspensions hautement homogènes.
   2. Homogénéisez les suspensions bactériennes avec une aiguille 26-G (15 séquences de montée et de bas), sonicez trois fois pendant 10 secondes (avec des pauses de 10 secondes entre chaque séquence de sonication) à l’aide d’un sonicateur au bain-marie. Ajoutez 1 ml de 7H9OADc/T et faites un vortex brièvement. Centrifugeuse 3 minutes à 100 x g.
   3. Collectez soigneusement les surnadants contenant des mycobactéries pour éviter les amas et concentrez les suspensions homogènes dans un tube plastique stérile de 50 ml.
   4. Vérifiez visuellement la présence d’agrégats bactériens restants éventuellement.
      REMARQUE : Si des granulats sont encore présents, procéder à une étape supplémentaire de centrifugation à 100 x g pendant 2 minutes, puis collecter le surnageant.
   5. Centrifugez la suspension à 4 000 x g pendant 5 minutes, resuspendez la pellete à 200 μl 7H9OADc/T et procédez à l’injection.
   6. Évaluer la concentration bactérienne finale en placant des dilutions en série (dans 1x PBST) sur l’agar 7H10OADc et en comptant les unités formatrices de colonies (UFC) après 4 jours d’incubation à 30 °C. Les UFC doivent être déterminées pour chaque nouveau lot.
   7. Préparez des stocks d’inocula congelés en stockant 5 μl d’aliquotes à -80 °C.
      REMARQUE : L’évaluation de l’UFC des aliquotes congelées à -80°C est une condition préalable pour déterminer le nombre exact de bactéries viables, car la gel/la décongélation peut affecter la viabilité bactérienne de l’inocule. Ces inocules congelés sont prêts à être utilisés pour des injections ultérieures. Puisque toutes les aliquotes contiennent le même nombre d’UFC, elles permettent d’injecter des bactéries de manière reproductible d’une expérience à une autre.
3. Contrôle qualité des inoculations
   REMARQUE : La coloration Ziehl-Neelsen (spécifique aux mycobactéries) peut être utilisée pour comparer la qualité des suspensions bactériennes avant et après les procédures d’homogénéisation.
   1. Placez et étalez une gouttelette de la suspension bactérienne homogénéisée sur une lame en verre et laissez-la sécher complètement. Fixez l’étalage pendant au moins 30 minutes sur une plaque chauffante réglée à 65-70 °C et colorez en utilisant un protocole de coloration Ziehl-Neelsen.
   2. Observez le frottis bactérien au microscope à l’aide d’un objectif 100X et comparez avec un frottis d’une suspension bactérienne non traitée (Figure 1).

2. Préparation des embryons de poisson-zèbre

1. Frai et collecte des œufs de poisson-zèbre
   1. La veille de la frai, faites reproduire des poissons-zèbres adultes en plaçant 2 mâles et 1 femelle (généralement un ratio de 2:1 permet un taux de fécondation optimal) dans une chambre de reproduction, composée d’un aquarium séparé avec un panier de collecte d’œufs.
      REMARQUE : Les paniers de collecte d’œufs servent à protéger les œufs de la consommation par les parents et à faciliter la récolte.
   2. À 1 hpf, prélèvez les œufs et ne conservez que les embryons correctement développés dans une boîte de Petri de 100 mm remplie de 25 ml d’eau de poisson bleu (maximum 100 embryons par plat) et maintenez-les à 28,5 °C. Les œufs non fécondés sont jetés.
2. Préparation d’embryons de poisson-zèbre pour les injections
   1. Vers 24 heures après la fécondation (HPF), déchorionez les embryons à la pince fine dans une boîte de Petri de 100 mm et maintenez-les à 28,5 °C.
   2. Collectez les 30 à 48 embryons de hpf à l’aide d’une pipette et transférez-les dans une chambre de positionnement en forme de « V » remplie de 25 ml d’eau de poisson contenant 270 mg/L de tricaïne. Placez correctement les embryons dans les canaux à l’aide d’un outil de pointe microchargeur maison (une pointe microchargeuse coupée maison) optimisé pour une micro-manipulation plus facile.
      REMARQUE : Orientez le côté dorsal vers le bas pour les injections intraveineuses dans la veine caudale ou le côté dorsal vers le haut pour les injections du muscle caudal.

3. Procédure de micro-injection

REMARQUE :. Pour évaluer la chronologie de l’infection par M. abcessus (survie, charges bactériennes, cinétique et caractéristiques de l’infection), il est recommandé d’injecter 30 embryons de HPF dans la veine caudale. Pour visualiser le recrutement des cellules immunitaires, les injections sont effectuées dans des sites localisés, comme dans les muscles de la queue d’un embryon de 48 hpf.

1. Diluez l’inoculum mycobactérien dans un PBST 1X (selon le nombre d’UFC à administrer), contenant 10 % de rhophile rouge afin de vérifier l’injection correcte.
2. Chargez une aiguille d’injection microcapillaire avec 5 à 10 μl de l’inocule bactérien à l’aide d’une pointe microchargeuse, connectez l’aiguille d’injection dans le support du micromanipulateur tridimensionnel relié à l’injecteur, et brisez le dessus de l’aiguille avec une pince fine pour obtenir un diamètre d’ouverture de 5 à 10 μm.
3. Calibrez le volume d’injection en ajustant la pression de microinjection (20-50 hPa) et le temps (0,2 sec).
   REMARQUE : Le volume d’injection requis est calibré par la détermination visuelle du diamètre d’une gouttelette expulsée dans le jaune d’un embryon.
4. Pour l’injection dans la veine caudale, placez l’embryon avec le côté ventral face à l’aiguille et placez la pointe de l’aiguille près de l’ouverture urogénitale, en ciblant la veine caudale, puis poussez doucement la pointe de l’aiguille dans l’embryon jusqu’à ce qu’elle perce juste la région de la veine caudale. Administrez le volume désiré de préparation bactérienne, généralement 1 à 3 nl contenant environ 100 UFC/nl.
5. Pour l’injection intramusculaire, positionnez l’embryon avec le côté dorsal face à l’aiguille, placez l’aiguille sur un somite, puis injectez un petit volume (1 nl) d’inocule.
   REMARQUE : En ce qui concerne les injections dans la veine caudale, les injections intramusculaires sont également difficiles à réaliser. Il faut veiller à éviter une surcharge, qui pourrait endommager les tissus environnants.
6. À la fin de la procédure d’injection, contrôlez la taille de l’inoculum en injectant le même volume de suspension bactérienne dans une goutte de PBST stérile, suivis du plaque à 7H10OADc et du comptage de l’UFC. Environ 100 embryons peuvent être injectés à l’aide d’une aiguille.
   REMARQUE : Comme l’abcès de M . rugueux peut continuer à former des agrégats dans l’aiguille, les injections doivent être effectuées immédiatement après la préparation de l’inoculum.
7. Transférer les poissons infectés individuellement sur des plaques à 24 puits contenant 2 ml/puits d’eau pour poissons et incuber à 28,5 °C. Les embryons injectés avec 1-3 nl 1X PBS peuvent être utilisés comme témoins.
8. L’infection correcte des bactéries fluorescentes dans les embryons est surveillée à l’aide d’un microscope à fluorescence.

4. Quantification de la charge bactérienne

1. Détermination par énumération des UFC
   1. Au moment souhaité, prélever des groupes d’embryons infectés (5 par condition) dans des tubes microcentrifuge de 1,5 ml (1 embryon/tube), cryo-anesthésier les embryons par incubation sur glace pendant 10 minutes, puis euthanasier à l’aide d’une surdose de tricaïne (300-500 mg/L)
   2. Lavez les embryons deux fois avec de l’eau stérile et distribuez-les dans un nouveau tube. Lysez chaque embryon avec du Triton X-100 à 2 % dilué dans 1X PBST à l’aide d’une aiguille 26-G, puis homogénéisez la suspension jusqu’à une lyse complète. Centrifugez la suspension et resuspendez le pellet en 1X PBST avec 0,05 % Tween 80. Les dilutions en série des homogénéats sont placées sur Middlebrook 7H10OADc et complétées avec du BBL MGIT PANTA, comme recommandé par le fournisseur.
      REMARQUE : M. abcès est plus susceptible au traitement NaOH que M. marinum. La décontamination des lysats de poissons sans affecter la croissance de M. abcès peut être réalisée avec succès grâce au cocktail d’antibiotiques BBL MGIT PANTA.
   3. Incubez les plaques pendant 4 jours à 30 °C et comptez les colonies.

Résultats

Figure 1. Préparation de l’inocule dispersée de M. abscessus.Coloration Ziehl-Neelsen des variantes R ou S cultivées sur un milieu de bouillon avant tout traitement (panneaux supérieurs) ou après traitement (pann...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Albumine sérique bovine	Euromedex	04-100-811-E
Catalase à partir du foie bovin	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Bouillon Difco Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310
Éthyle 3-aminobenzoate méthanassulfonate sel (Tricaïne)	Sigma-Aldrich	A5040
Acide oléique	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformélélidoïde	Delta Microscopie	15710
Rouge phénol	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Agarose à faible fusion	Sigma-Aldrich
Sels marins instantanés de l’océan	Aquarium Systems Inc
Capillaires en verre borosilicate	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm de polarité de sortie x 0,78 mm de diamètre de retraite.
Dispositif de tirage de micropipette	Sutter Instrument Inc		Extracteur de micropipette à flamme/brun p-87
Microinjecteur	Recherche Tritech		MicroINJECTEUR numérique, MINJ-D
Pince à épiler	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Embouts de microchargeur	Eppendorf