Modéliser la pathogenèse d’Aeromonas chez C. elegans à l’aide d’un test de survie

Résumé

Source : Chen, Y., et al. Évaluation de la virulence et de la pathogenèse de l’infection par Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre un test de survie utilisant C. elegans pour modéliser la pathogenèse d’Aeromonas , où l’ingestion orale de la bactérie entraîne une infection intestinale et une mortalité, permettant une évaluation quantitative de la virulence bactérienne dans un système hôte vivant.

Protocole

1. Essai de survie de C. elegans avec Aeromonas

1. Le jour de la sémination des vers L1 sur le milieu de croissance ENGM (nématode enrichi) en se propageant avec E. coli OP50, choisissez une seule colonie de chacune des quatre souches d’Aeromonas ou d’E. coli OP50 et cultivez avec un bouillon de 2 mL LB, respectivement, à 37 °C pendant 16 heures.
   REMARQUE : Pour éviter toute contamination, cette étape doit être effectuée dans une hotte à écoulement laminaire. Ici, les souches bactériennes suivantes ont été utilisées : E. coli OP50, la source alimentaire normale de C. elegans. A. dhakensis AAK1, le premier isolat clinique pathogène d’A. dhakensis entièrement séquencé. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 et A. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentatifs de l’Hôpital National Cheng Kung University.
2. Mesurez l’absorbance OD₆₀₀ (densité optique à 600 nm) du bouillon bactérien et ajustez le bouillon bactérien à_{OD 600} = 2,0 avec LB de bouillon.
3. Localiser et répartir 30 μL de bouillon bactérien sur chaque plaque de 6 cm NGM (milieu de croissance nématode). Cultivez les plaques à température ambiante toute la nuit.
   REMARQUE : Pour préparer la NGM, dissoudez 3 g de NaCl (chlorure de sodium), 2,5 g de peptone bactérienne et 20 g d’agar dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 °C pendant 20 minutes. Attendez qu’il refroidisse à 55 °C dans un bain-marie, puis ajoutez 1 mL de 1 M_CaCl2 (chlorure de calcium), 1 mL de 1 M_{MgSO 4} (sulfate de magnésium), 1 mL de cholestérol à 5 % d’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Faites tourner pour bien mélanger.
4. Le jour où les vers L1 atteignent le stade L4, choisissez et transférez aléatoirement 50 vers sur une plaque NGM avec chacune des quatre souches Aeromonas ou E. coli OP50.
5. Incubez les plaques NGM à 20 °C jusqu’à la fin du test.
6. Transférez tous les vers vivants sur une plaque NGM nouvellement préparée avec des bactéries et comptez chaque jour le nombre de vers vivants, morts et capteurs jusqu’à ce que le dernier soit mort.
   REMARQUE : Transférez les vers sur une plaque NGM fraîchement préparée chaque jour pour l’entretien de l’infection, même avec des vers stériles (par exemple, GLP-4 ou avec FudR).
7. Tracez les courbes de survie à partir du calcul quotidien des données.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur à shaker	YIH DER	LM-570R	Incubation bactérienne
NaCl	SIGMA	31434	Préparation du milieu culturel
MgSO₄	SIGMA	M7506	Préparation du milieu culturel
Agar	Difco	214530	Préparation du milieu culturel
CaCl₂	SIGMA	C1016	Préparation du milieu culturel
Cholestérol	SIGMA	C8503	Préparation du milieu culturel
Plaque de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Préparation de la plaque d’agar
Peptone bactérienne	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Préparation du milieu culturel
FudR	SIGMA	1271008	Préparation du milieu culturel
Système de microscope	Nikon	Éclipase Ti inversée	Imagerie au microscope