Évaluation de la virulence bactérienne à l’aide du test de toxicité liquide de C. elegans

Abstract

Source : Chen, Y., et al. Évaluation de la virulence et de la pathogenèse de l’infection par Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente le test de toxicité liquide de C. elegans avec Aeromonas, une méthode utilisée pour évaluer la virulence bactérienne en mesurant la survie des vers dans un environnement liquide limité en nutriments. Le test révèle une pathogénicité spécifique à la souche basée sur l’étendue des dommages et de la mortalité induits par la toxine chez C. elegans.

Protocol

1. Dosage de toxicité liquide de C. elegans avec Aeromonas

REMARQUE : Pour éviter toute contamination, des étapes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement laminaire.

1. Le lendemain de la sémination des vers L1 sur la plaque ENGM (milieu de croissance enrichi pour nématodes) avec E. coli OP50, sélectionnez une seule colonie de chacune des quatre souches Aeromonas et E. coli OP50, et cultivez avec un bouillon de 5 mL LB chacun à 37 °C pendant 16 heures.
   REMARQUE : Dans le protocole, les souches bactériennes suivantes ont été utilisées : E. coli OP50, la source alimentaire normale de C. elegans. A. dhakensis AAK1, le premier isolat clinique pathogène entièrement séquencé d’A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 et A. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentatifs de l’hôpital national universitaire Cheng Kung.  
   REMARQUE : Pour préparer une GNM enrichie (ENGM), dissoudez 3 g de NaCl, 5 g de peptone bactérienne, 1 g d’extrait de levure et 30 g d’agar dans 1 L d’eau déionisée. Autoclave à 121 °C pendant 20 minutes. Attendez qu’il soit refroidi à 55 °C dans un bain-marie, puis ajoutez 1 mL de 1 M_{CaCl 2}, 1 mL de 1 M_{MgSO 4}, 1 mL de cholestérol à 5 % d’éthanol et 25 mL de tampon phosphate. Faites tourner pour bien mélanger.
2. Mesurez l’absorption OD₆₀₀ du bouillon de bactéries.
3. Centrifugez le bouillon bactérien à 3 500 x g pendant 15 minutes pour retirer le bouillon LB. Resuspendez les bactéries et ajustez le bouillon bactérien à un OD₆₀₀ = 3,0 avec un milieu S. Ajoutez 195 μL de bouillon bactérien dans un milieu S à au moins 8 puits d’une plaque à 96 puits.
   REMARQUE : Composition du milieu S : Pour préparer le milieu S, mélangez 40 mL de basal S, 0,4 mL de citrate de potassium 1 M, 0,4 mL de solution de métaux traces, 0,12 mL de 1 M_{CaCl 2}, 0,12 mL de 1 M_{MgSO 4}, 40 μL de cholestérol à 5 % dans l’éthanol et 1 mL de 8 mM FudR avant utilisation.
4. Rince les vers L4 sur la plaque ENGM avec de l’E. coli OP5 en utilisant un médium M9. Ajustez la solution de ver à une concentration de 5 vers par μL et ajoutez 5 μL de la solution de vers à chaque puits de la plaque à 96 puits. Assurez-vous qu’il y ait environ 25 vers par puits.
5. Incubez la plaque à 96 puits sur un shaker à 200 tr/min à 25 °C.
6. Comptez le nombre de vers vivants et morts après 24, 48 et 72 heures. Calculez les taux de survie de chaque puits avec la formule suivante : (vers vivants/vers totaux) × 100 %.
7. Dessinez un graphique de points avec le calcul quotidien des données.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubateur à shaker	YIH DER	LM-570R	Incubation bactérienne
NaCl	SIGMA	31434	Préparation du milieu culturel
MgSO₄	SIGMA	M7506	Préparation du milieu culturel
Agar	Difco	214530	Préparation du milieu culturel
CaCl₂	SIGMA	C1016	Préparation du milieu culturel
Cholestérol	SIGMA	C8503	Préparation du milieu culturel
Éthanol	SIGMA	32205	Préparation du milieu culturel
KOH	SIGMA	P5958	Préparation du milieu culturel
Plaque de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Préparation de la plaque d’agar
Plaque à 96 puits	FALCON	353072	Analyse liquide
Peptone bactérienne	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Préparation du milieu culturel
Extrait de levure	SIGMA	92144	Préparation du milieu culturel
Acide citrique•H₂O	SIGMA	Vers 1909	Préparation du milieu culturel
Citrate de tri-potassium•H₂O	SIGMA	104956	Préparation du milieu culturel
FudR	SIGMA	1271008	Préparation du milieu culturel
EDTA disodique	SIGMA	E1644	Préparation du milieu culturel
Tryptone	SIGMA	16922	Préparation du milieu culturel
Système de microscope	Nikon	Éclipase Ti inversée	Imagerie au microscope
Caméra CCD scientifique	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagerie au microscope