Essai de nécrose musculaire chez C. elegans induit par une souche pathogène d’Aeromonas

Résumé

Source : Chen, Y. et al., Évaluation de la virulence et de la pathogenèse de l’infection par Aeromonas dans un modèle de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre un test de nécrose musculaire chez C. elegans (Caenorhabditis elegans) utilisant des souches pathogènes d’Aeromonas . En nourrissant des vers exprimant des protéines fluorescentes vertes (GFP) sur des plaques ensemencées dans Aeromonas, le test modélise l’infection bactérienne et révèle des lésions tissulaires grâce à l’imagerie par fluorescence. La perte progressive de la structure musculaire et du signal GFP indique une réponse nécrotique induite par Aeromonas.

Protocole

1. Essai de nécrose musculaire de Caenorhabditis elegans avec Aeromonas

REMARQUE : Pour éviter toute contamination, ces étapes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement laminaire.

1. Le jour où les vers L1 sont ensemencés sur le milieu de croissance enrichi des nématodes (ENGM) diffusé avec Escherichia coli OP50, sélectionnez une colonie unique de chacune des quatre souches d’Aeromonas et d’E. coli OP50 et cultivez avec 2 mL de bouillon Luria-Bertani (LB) chacun à 37 °C pendant 16 heures. REMARQUE : Ici, les souches bactériennes suivantes ont été utilisées : E. coli OP50, la source alimentaire normale de C. elegans. A. dhakensis AAK1, le premier isolat clinique pathogène clinique de A. dhakensis entièrement séquencé. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 et A. caviae A2-9307121 sont des isolats cliniques représentatifs de l’Hôpital National Cheng Kung University.
2. Mesurez l’absorption OD₆₀₀ du bouillon de bactéries et ajustez le bouillon de bactéries à_{OD 600} = 2,0 avec LB de bouillon. Localiser et disperser 30 μL de bouillon bactérien sur des plaques de milieu de croissance nématode (NGM) de 6 cm. Cultivez les plaques à température ambiante toute la nuit.
3. Le jour où les vers L1 atteignent l’étape L4, transférez 50 vers à chaque plaque NGM avec chacune des quatre souches d’Aeromonas ou E. coli OP50. Incubez les plaques NGM à 20 °C. Transférez les vers toutes les 24 heures vers vers des plaques NGM nouvellement préparées avec des bactéries.
4. Prenez des images musculaires à l’aide d’un microscope à fluorescence.
   1. Choisis au hasard 10 vers sur un gel d’agarose à 2 % dans un milieu M9 sur une lame. Paralysez les vers à l’aide de 2 μL d’azide de sodium à 1 % dans un milieu M9 sur de l’agarose pendant moins de 5 minutes avant de prendre des images.
   2. Placez une gaine de couverture et capturez les images musculaires à l’aide d’un filtre à protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope fluorescent muni d’une caméra à dispositif couplé en charge. Capturez les images musculaires à 24, 48 et 72 heures après le stade L4.

Effectuez une analyse d’image et une préparation de figures avec un logiciel de traitement d’image.
REMARQUE : Les définitions des scores et des niveaux de lésions musculaires sont présentées à la Figure 1, pour laquelle les critères sont listés comme suit : 3 points pour l’absence de fibres musculaires ; 2 points pour fibres musculaires rompues ou cassées ; 1 point pour les fibres musculaires tordues ; 0 point pour des fibres musculaires saines.

Résultats

Figure 1 : Les scores correspondants pour la nécrose musculaire chez C. elegans induite par l’infection à Aeromonas . Les critères pour la nécrose musculaire et les scores...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur à shaker	YIH DER	LM-570R	Incubation bactérienne
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Préparation du milieu culturel
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Préparation du milieu culturel
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Préparation du milieu culturel
NaCl	SIGMA	31434	Préparation du milieu culturel
MgSO₄	SIGMA	M7506	Préparation du milieu culturel
Agar	Difco	214530	Préparation du milieu culturel
CaCl₂	SIGMA	C1016	Préparation du milieu culturel
Cholestérol	SIGMA	C8503	Préparation du milieu culturel
Éthanol	SIGMA	32205	Préparation du milieu culturel
KOH	SIGMA	P5958	Préparation du milieu culturel
Plaque de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Préparation de la plaque d’agar
Peptone bactérienne	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Préparation du milieu culturel
Extrait de levure	SIGMA	92144	Préparation du milieu culturel
Acide citrique•H₂O	SIGMA	Vers 1909	Préparation du milieu culturel
Citrate de tri-potassium•H₂O	SIGMA	104956	Préparation du milieu culturel
FudR	SIGMA	1271008	Préparation du milieu culturel
EDTA disodique	SIGMA	E1644	Préparation du milieu culturel
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Préparation du milieu culturel
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Préparation du milieu culturel
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Préparation du milieu culturel
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Préparation du milieu culturel
Tryptone	SIGMA	16922	Préparation du milieu culturel
Système de microscope	Nikon	Éclipase Ti inversée	Imagerie au microscope
Caméra CCD scientifique	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagerie au microscope