Stabilisation médiée par les fibres de Curli des motifs hydrogélique bactériens

Résumé

Source : Spiesz, E. M., et al., Patterning tridimensionnel of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre une méthode pour comparer des motifs d’alginates imprimés en 3D contenant soit des souches bactériennes témoins, soit génétiquement modifiées. La souche d’essai produit des fibres de curli lors de l’induction, qui renforcent la structure d’hydrogel d’alginate. Après un traitement par solution chélante de calcium, seul le schéma de test reste intact, mettant en lumière l’effet stabilisateur de la production de fibres de curli.

Protocole

1. 3D procédé d’impression

1. Installez et ouvrez le logiciel d’impression 3D (Table of Materials) sur un ordinateur. Connectez l’imprimante 3D à l’ordinateur. Déplacez la tête d’impression à sa position d’origine en cliquant sur le bouton d’accueil des axes X, Y et Z.
2. Pour chaque impression, placez un support d’impression préparé à un endroit précis sur le plateau.
3. Calibrez la hauteur de la tête d’impression sur l’axe Z.
   1. Faites monter la tête d’impression à une hauteur de 22 mm en contrôlant manuellement, afin qu’elle ne percute pas le bord de la boîte de Petri lors du déplacement vers la position souhaitée. Placez la tête d’impression au-dessus de la plaque, puis faites-la descendre jusqu’à ce que la pointe de la pipette touche la surface d’impression. Attribuez à cette position de l’axe Z comme Z1 (la hauteur de la surface d’impression).
   2. Releverez la tête d’impression et déplacez-la hors de la zone de la plaque en contrôlant manuellement les axes X, Y et Z. Si la distance de travail entre la tête d’impression et la surface de la plaque est définie comme Z2, entrez Z1 + Z2 dans le programme d’impression comme valeur Z lors de l’impression.
4. Programmez la forme d’impression selon une méthode auto-développée point par point et déterminée par coordonnées selon la trajectoire souhaitée.
   1. Si la trajectoire souhaitée est une ligne droite, on ne définit que les points de départ et de fin. Ajouter des points supplémentaires sur des lignes courbes donnera des courbes plus lisses. Déplacez manuellement la tête d’impression vers chaque point séquentiellement, et notez les coordonnées de ces points dans l’ordre. Entrez toutes ces coordonnées ainsi que la vitesse de déplacement de la tête d’impression pour chaque segment imprimé dans l’éditeur G-code.
5. Avant et après l’impression, soulevez la tête d’impression à une distance au-dessus du bord de la plaque (20 mm), puis déplacez-vous directement hors de la région de la plaque. Enregistrez ce programme en fichier G-code et chargez directement pour une utilisation dans les impressions suivantes, tout en remesurant la hauteur de l’axe Z pour chaque nouveau support d’impression.
   REMARQUE : Voir le tableau 1 pour un exemple de code G pour imprimer un carré.
6. Chargez le fichier G-code préprogrammé. Ouvrez l’éditeur G-code dans le logiciel, et programmez les commandes pour imprimer la forme désirée. À chaque ligne de commande, la position de la tête d’impression peut être modifiée sur les axes X, Y et/ou Z. Saisissez la valeur Z lors de toutes les étapes d’impression comme Z1 + Z2 (hauteur de surface d’impression + distance de travail).
   REMARQUE : La vitesse de déplacement est également réglable ; 9 000 mm/min est une valeur adaptée pour les débits d’impression typiques.
7. Chargez l’encre biologique liquide dans une ou plusieurs seringues, et montez-les dans la ou les pompes à seringues de la bioimprimante 3D.
8. Imprimez l’encre biologique sur le substrat d’impression en cliquant sur le bouton Imprimer.
9. Lors de l’impression, contrôlez entièrement le mouvement de la tête d’impression par le logiciel. Démarrez manuellement la pompe à seringue avant que la tête d’impression ne touche la surface d’impression.
   REMARQUE : La coordination entre la pompe à seringue et l’imprimante est déterminée empiriquement en fonction de la vitesse d’extrusion, de la vitesse à laquelle la tête d’impression se déplace vers le premier point d’impression, et de la position initiale de la tête d’impression. Si la position initiale de la tête d’impression est de 20 mm, avec une vitesse de 9 000 mm/min et une vitesse d’extrusion de 0,1 mL/h, démarrez la pompe à seringue immédiatement après le début de l’impression. Si la vitesse d’extrusion passe de 0,1 mL/h à 0,3 mL/h, attendez 2−3 s pour démarrer la pompe à seringue après le début de l’impression.
10. Arrêtez la pompe à seringue dès que la tête d’impression arrive au dernier point d’impression. Arrêtez la pompe à seringue avant que la tête d’impression ne se soulève à la fin du processus d’impression, sinon un excès d’encre biologique tombera sur le substrat d’impression et réduira la résolution d’impression.
11. Pour la construction de structures 3D, contrôlez tous les mouvements de la tête d’impression dans l’éditeur G-code. Tape la hauteur d’impression de la première couche. Augmentez la valeur Z dans le G-code de 0,2 millimètre pour la seconde couche afin d’augmenter la hauteur d’impression. Ensuite, augmentez la valeur Z de 0,1 millimètre lors du passage à une couche supérieure. Ne bougez pas la plaque pendant le processus d’impression.
12. Pour mesurer la largeur et la hauteur de l’hydrogel imprimé, utilisez une règle en acier placée en dessous ou à côté de l’échantillon.

2. Cultiver et tester l’efficacité de la production de biofilms par E. coli

1. Incubez les échantillons imprimés à température ambiante pendant 3 à 6 jours afin de permettre la production des composants de biofilm (fibres de curli). Imagez les plaques avec un appareil photo ou un scanner fluorescent.
2. Pour dissoudre la matrice d’alginate, ajoutez 20 mL de solution de citrate de sodium 0,5 M (pH = 7 ajusté avec NaOH) aux substrats d’impression, puis incubez pendant 2 h en secouant 30 tr/min à température ambiante. Écartez le liquide et imagez à nouveau les plaques pour les comparer avec celles des plaques avant le traitement au citrate.

Tableau 1 : Processus de programmation et explications du G-code pour l’impression d’un carré.

Commandes G-code	Tâches
G1 Z20 F9000	Soulevez l’axe Z à une hauteur de 20 mm avec une vitesse de déplacement de 9 000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Avancez jusqu’au point de départ de la première ligne avec une vitesse de déplacement de 9 000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Descendez dans la direction Z jusqu’à une distance d’impression propre (ici Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300	Point de fin de la première ligne et point de départ de la deuxième ligne.
G1 X135 Y105	Point de fin de la deuxième ligne et point de départ de la troisième ligne.
G1 X135 Y65	Point d’arrivée de la troisième ligne et point de départ de la quatrième ligne.
G1 X95 Y65	Point d’arrivée de la quatrième ligne et point de départ de la première ligne ; un carré se forme.
G1 Z20 F9000	Soulevez l’axe Z à une hauteur de 20 mm à 9 000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Passez à une coordonnée (55, 40) en dehors de la plage de la boîte de Petri.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre de bouillon LB	Sigma-Aldrich	L3022
Secoueur orbital	VWR	89032-092	Modèle 3500
Boîte de Petri	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Tubulure en silicium	VWR	DENE 3100103/25
Pompe à seringue	ProSense B.V.	NE-300
Alginate de sodium	Sigma-Aldrich	W201502
Monobase de citrate de sodium	Sigma-Aldrich	71498
Hydroxyde de sodium	VWR	28244.295