1. Installation du microscope et acquisition en time-lapse
REMARQUE : Le protocole décrit ici a été développé pour un microscope à champ large inversé avec autofocus, un objectif PH3 huile 100X/1,30 NA, un étage motorisé X, Y, une caméra sCMOS, une source lumineuse, des filtres pour protéines fluorescentes vertes, rouge-fluorescentes ou fluorescentes jaunes, ainsi qu’une chambre d’incubation à température contrôlée. Cette chambre maintient les cellules protégées de la lumière et à une température constante.
- Préchauffez la chambre d’incubation et le microscope à 32 °C pendant ~1 à 2 heures avant de commencer la microscopie.
REMARQUE : Selon l’installation du microscope, le chauffage peut prendre plus de temps. Le préchauffage est essentiel pour réduire la dérive et stabilise le système de contrôle de l’autofocus. - Allumez le microscope et lancez le logiciel de contrôle du microscope. Sélectionnez l’objectif correct ainsi que les bons miroirs et filtres pour acquérir des images en contraste de phase ainsi que des images de protéines fluorescentes vertes, rouges fluorescentes ou fluorescentes jaunes.
REMARQUE : Un microscope est généralement fourni avec un logiciel préféré pour le contrôle et l’acquisition d’images du microscope. Ici, un logiciel commercialement disponible (voir le tableau des matériaux) était utilisé pour contrôler le microscope et l’acquisition d’images. - Ajoutez une goutte d’huile d’immersion de haute qualité sur la lentille objective et au fond de l’échantillon, pré-incubée à 32 °C. Placez l’objectif à la position Z la plus basse possible pour éviter de l’endommager lors de la pose de l’échantillon sur l’étage du microscope. Placez le cadre métallique avec l’échantillon sur l’étage du microscope, avec le « côté trou » vers l’objectif. Fixez l’échantillon solidement dans le porte-élastique.
- Concentrez-vous sur les cellules en rapprochant l’étage dans la direction Z de l’objectif. Déplacez lentement l’étage lorsque l’huile tombe sur le bas de l’échantillon et que l’objectif entre en contact. Déplacez l’étage dans la direction X/Y jusqu’à ce que plusieurs cellules individuelles soient visibles dans la région de vue, lorsque les cellules sont dans le plan focal. Assurez-vous qu’au moins une microsphère fluorescente se trouve dans la région de vue afin d’aligner plus tard les images acquises.
REMARQUE : Dans des conditions optimales, une densité cellulaire de 15 à 30 cellules par région de vision (2 048 x 2 048 pixels ou 133,1 x 133,1 μm) devrait être atteinte. - Ouvrez l’assistant d’acquisition multidimensionnelle du logiciel de contrôle du microscope pour mettre en place une expérience en accéléré temporel permettant au microscope d’acquérir des images à plusieurs longueurs d’onde et positions de scène si nécessaire.
- Dans l’onglet principal, activez Timelapse et Multiple Wavelengths. Des onglets supplémentaires apparaîtront sur le côté gauche de la fenêtre.
- Cliquez sur l’onglet Enregistrer et sélectionnez Répertoire pour sélectionner un dossier vide sur le disque dur de l’ordinateur afin d’enregistrer les images acquises. Activez le nom de base d’Inccrémentement si le fichier existe pour vous assurer que les ensembles de données consécutifs ne surécrasent pas les précédents. Ensuite, donnez à l’expérience un nom avec la date et le nom ou le titre de la souche de l’expérience.
- Cliquez sur l’onglet Time-lapse pour ajuster les paramètres du time-lapse. Réglez la durée à 24 heures et l’intervalle de temps à 20 minutes. Le nombre de points de temps changera automatiquement.
REMARQUE : L’intervalle de temps optimal dépend de l’expérience et de la fonction cellulaire à analyser. Des acquisitions fréquentes d’images peuvent provoquer un photoblanchiment. Ainsi, un compromis entre la résolution temporelle et le photoblanchiment doit être trouvé empiriquement. À un temps de doublement de 4 à 6 heures, les images peuvent être facilement acquises à intervalles de 5 minutes (ou même plus petits si désiré) pour la microscopie à contraste de phase. Si l’on souhaite une microscopie à fluorescence sur une période de 24 heures, les images doivent être enregistrées à un intervalle d’environ 15 à 30 minutes. - Cliquez sur l’onglet Longueurs d’Onde . Sélectionnez le nombre de longueurs d’onde à acquérir pour chaque image à chaque moment en changeant le nombre.
REMARQUE : Pour chaque longueur d’onde, un nouvel onglet apparaîtra sur le côté gauche de l’assistant « Acquisition Multidimensionnelle » et les longueurs d’onde seront acquises dans l’ordre de haut en bas. Pour chaque longueur d’onde, les réglages d’acquisition peuvent être modifiés séparément. - Cliquez sur le premier onglet longueur d’onde depuis le haut. Sélectionnez Contraste de phase dans la liste déroulante Illumination . Sélectionnez 100 ms pour Exposition et sélectionnez Chaque Point d’Heure dans la liste déroulante Acquisition . Désactivez l’Exposition Automatique en sélectionnant Jamais dans la liste déroulante.
- Répétez l’étape 3.5.5 pour chaque longueur d’onde à acquérir à chaque moment précis. Pour la configuration expérimentale et les protéines marquées fluorescentement décrites ici, utilisez les paramètres suivants pour l’exposition : 250 ms pour les protéines de fusion mCherry, 200 ms pour les protéines de fusion YFP (protéine fluorescente jaune), et 1 000 ms pour les protéines de fusion GFP (protéine fluorescente verte).
REMARQUE : Les réglages optimaux d’éclairage pour chaque souche et protéine fluorescente doivent être déterminés à l’avance en modifiant l’intensité de la lampe et le temps d’acquisition de l’image pour chaque longueur d’onde. Des temps d’acquisition d’image trop longs augmentent l’effet phototoxique et conduisent finalement à l’arrêt de la croissance et à la mort cellulaire. Par conséquent, un compromis entre la qualité de l’image et la viabilité de la cellule doit être réalisé. - Acquérir des images de plusieurs positions de stade pour augmenter le nombre de cellules enregistrées dans la même expérience.
- Pour obtenir des images de plusieurs positions de scène, activez Positions multiples de scène dans l’onglet principal . Puis cliquez sur l’onglet Stage et cliquez sur le bouton Live pour voir le champ de vision.
- Déplacez la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’une région d’intérêt (ROI) soit dans le champ de vision. Enregistrez les coordonnées X et Y en cliquant sur le « + » dans l’onglet Stage . Déplacez à nouveau la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’un nouveau ROI soit trouvé et enregistrez à nouveau les coordonnées en cliquant sur le « + ». Continuez jusqu’à ce que le nombre désiré de régions soit sauvegardé.
REMARQUE : En cas d’acquisition d’images fluorescentes, assurez-vous que les régions d’intérêt (ROI) ne sont pas trop proches les unes des autres pour minimiser la phototoxicité.
- Vérifiez une fois de plus que les cellules sont nettes en cliquant sur les différentes positions X et Y enregistrées, puis lancez l’autofocus matériel en appuyant sur AFC maintenu pour maintenir la position Z enregistrée constante au cours de l’expérience.
- Commencez les enregistrements en accéléré dans le logiciel de contrôle du microscope en cliquant sur Acquérir dans l’assistant Acquisition Multidimensionnelle .
REMARQUE : Une fenêtre apparaîtra pour chaque longueur d’onde acquise, et une fenêtre supplémentaire affichera le nombre de points temporels acquis et le temps jusqu’à la prochaine acquisition de l’image. - Vérifiez que les cellules sont toujours nettes après les premiers moments des enregistrements en accéléré afin de maximiser la qualité des images et refocalisez si nécessaire.