Imagerie en accéléré de cellules vivantes de la prédation de Bdellovibrio bacteriovorus sur E. coli

Résumé

Source : Makowski, Ł., et al. Imagerie cellulaire vivante du cycle de vie du prédateur bactérien Bdellovibrio bacteriovorus à l’aide de microscopie à fluorescence en accéléré. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’imagerie fluorescente en accéléré de Bdellovibrio bacteriovorus s’attaqueant à E. coli immobilisé sous un coussinet d’agarose, permettant une visualisation en temps réel de la réplication intracellulaire et de la libération de la progéniture pour étudier la prédation bactérienne et les interactions hôte-pathogène.

Protocole

1. Conduction de la microscopie à fluorescence en accéléré

1. Placez la boîte de 35 mm dans le porte-boîte de Petri de façon à ce qu’elle ne bouge pas pendant l’expérience. Placez une goutte d’huile d’immersion (indice de réfraction de 1,518) sur l’objectif ainsi que sur le fond de la plaque de 35 mm.
2. Montez le support sur la scène du microscope inversé dans la chambre du microscope.
3. Configurez les options dans le logiciel de contrôle du microscope pour collecter plusieurs images à différents niveaux au fil du temps.
   1. Réglez le grossissement (100x) et la lentille polychrome (GFP (protéine fluorescente verte)/mCherry). À l’aide d’un oculaire et d’un champ clair (BF), trouvez le plan focal et ouvrez le gestionnaire de liste de points.
   2. Sélectionnez au moins 10 positions d’intérêt en déplaçant la scène et en stockant les coordonnées de chaque position dans le logiciel du microscope en cliquant sur le bouton de marquer le point . Évitez les positions proches les unes des autres pour éviter le photoblanchiment et la phototoxicité. Tournez la valve de l’appareil photo de l’oculaire vers le moniteur et calibrez chaque point en réglant le plan focal et en cliquant sur le bouton Remplacer un point dans le gestionnaire de la liste de points.
   3. Ouvrez le concepteur d’expériences et définissez tous les paramètres expérimentaux dans chaque onglet comme suit :
      1. Démarquez la boîte de rangement Z .
      2. Choisissez les canaux fluorescents et réglez les réglages optimaux d’éclairage. Ici, les réglages suivants ont été utilisés : pour le canal mCherry, les ensembles de filtres mCherry (EX575/25 ; EM625/45), une intensité de 50 % et un temps d’exposition de 200 ms ; pour le canal GFP, ensemble de filtres GFP (EX475/28 ; EM525/48), une intensité de 50 %, et 80 ms ; et pour les images BF, canal POL, intensité de 5 % et 50 ms.
      3. Sélectionnez les intervalles entre l’acquisition des images et le temps total de l’expérience. Ici, des intervalles de 5 minutes ont été effectués sur la période de 10 heures de l’expérience.
      4. Activez la maintenance de la mise au point pour les positions choisies (pour le système utilisé ici, en cochant la case Maintenir la mise au point avec UltimateFocus ).
      5. Sélectionnez le dossier de données dans lequel les fichiers image doivent être automatiquement sauvegardés.
      6. Revérifiez tous les réglages dans le contrôle logiciel du microscope, puis lancez l’expérience en accéléré.
4. Après la première heure de l’expérience, vérifiez que toutes les positions des scènes sont toujours nettes. Ajustez la mise au point pendant les intervalles de temps entre les acquisitions d’images, si nécessaire.
5. Lorsque l’expérience en accéléré est terminée, retirez la boîte de Petri et utilisez la plaque de 35 mm avec un tampon d’agarose conformément au protocole de biosécurité.
   REMARQUE : Toutes les sous-étapes après l’étape 1.2 sont spécifiques aux utilisateurs DeltaVision Elite. Les chercheurs utilisant d’autres systèmes doivent ajuster les réglages selon les systèmes individuels.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Biologie moléculaire certifiée Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarose à faible fluorescence pour le coussin d’agarose
Fidji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Logiciel de traitement d’image open source
Antenne à fond en verre 35 mm	ibidi	81218-200	Verre non enduit
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, module laser ultime, caméra DV Elite CoolSnap HQ2, assemblage SSI FP DV, kit objj. Oly 100x huile 1.4 NA, prisme Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
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