Visualisation de la distribution bactérienne des protéines en trois dimensions par imagerie de fluorescence

Résumé

Source : Bratton, B. P., et al., Imagerie tridimensionnelle des cellules bactériennes pour des représentations cellulaires précises et une localisation précise des protéines. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la méthode d’acquisition et d’analyse d’images de fluorescence tridimensionnelles des cellules bactériennes afin d’étudier l’organisation des protéines au niveau de la cellule unique.

Protocole

1. Imagerie

1. Insérez la lame scellée sur le microscope et laissez-la reposer 5 minutes pour équilibrer la température avec l’environnement. La salle du microscope peut être à une température différente de celle de la salle de préparation de l’échantillon.
2. Prenez une pile z fluorescente de l’échantillon.
   REMARQUE : La pile z doit recouvrir entièrement l’échantillon avec un espacement z inférieur à la profondeur du champ. Pour une cellule d’E. coli à 1,45 NA 100x et ~1 μm d’épaisseur, 40 pas à 100 nm par pas fonctionnent bien. Pour les cellules plus grandes ou celles qui ne sont pas parfaitement plates à la surface, 50 étapes ou plus peuvent être nécessaires. Incluez suffisamment d’étapes et assurez-vous que l’échantillon est complètement flouté au-dessus et en dessous.
   1. Utilisez le logiciel associé au microscope (voir Tableau des matériaux) pour contrôler le microscope.
   2. Faites la mise au point au centre de la cellule à l’aide des roues de mise au point du microscope. Sous acquisition ND, cochez la case Z pour prendre une pile z. Cliquez sur le bouton Home pour définir le centre de la cellule comme point de départ. Réglez la taille du pas à 0,1 μm et la portée à 4 μm. Assurez-vous que le dispositif Z est réglé sur l’étape piézo.
   3. Réglez les canaux fluorescents sous la fenêtre Lambda sur les réglages des molécules fluorescentes à imager. Dans cette expérience, la GFP et la mCherry ont été utilisées.
      REMARQUE : Prendre une pile z supplémentaire avec la même taille et plage de pas dans le second canal de couleur si la distribution 3D d’un canal fluorescent supplémentaire est souhaitée. Dans cette expérience, le mCherry cytoplasmique a été utilisé pour déterminer la forme cellulaire et le MreB-GFP a servi de second canal coloré.
   4. Assurez-vous que l’ordre de l’expérience est réglé sur lambda (série z) afin qu’il prenne une pile z complète dans chaque canal de couleur avant de changer.
   5. Cliquez sur Exécuter maintenant pour commencer l’acquisition de l’image et sauvegardez le fichier une fois qu’une ou les deux piles z sont terminées.
   6. Déplacez-vous dans une nouvelle zone sur la plateforme et répétez les étapes 1.2.2-1.2.5.

2. Reconstruction cellulaire

1. Recadrez des cellules individuelles et enregistrez les images sous forme de fichier tiff empilé afin qu’il n’y ait qu’une seule cellule par fichier. Assurez-vous que cette cellule est bien isolée de toutes les autres cellules (c’est-à-dire environ 5 fois la moitié maximale de la largeur totale de la fonction de floutage dans xy).
   REMARQUE : Cela peut être fait à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image gratuit (voir Tableau des matériaux).
   1. Dessinez une case autour d’une cellule individuelle et dupliquez cette cellule 2x, une fois pour chaque canal. Assurez-vous que la boîte d’hyperstack dupliqué est cochée et changez le canal en 1 ou 2, en veillant à ce que les tranches incluent toute la pile z.
      REMARQUE : Si l’imagerie est uniquement de la forme des cellules et non d’une protéine fluorescente supplémentaire, un seul canal sera présent.
   2. Une fois les deux piles disponibles, allez à Images | Stacks | Outils | Concatatèlez pour combiner les images avec le canal protéique d’abord et ensuite le canal de forme.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Coton-tige	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Utilisé pour appy VaLaP
Cartes de couverture	VWR	16004-302
Fidji	ImageJ	https://fiji.sc	Utilisé pour cro des cellules
Lanoline	Sigma-Aldrich	L7387	Combinez avec du paraffine et de la vaseline pour obtenir du VaLaP
Milieu de croissance LB	BD Difco	DF0446173
M63 moyen	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		Besoin d’exécuter des scripts de convolution vers l’avant
Lames de microscope	Fisher	12-550-133
Éléments NIS	Nkon
Paraffine	Sigma-Aldrich	327212
Vaselina	Égal	49035-038-27
Étage piezo z	Nikon	77011589
Pointes de pipet - p200	USA Scientific	1111-0730
Pointes de pipette - p10	USA Scientific	1111-3730