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1. Détermination des niveaux de colonisation intestinale
REMARQUE : La colonisation intestinale est la métrique la plus utile dans le modèle du poisson-zèbre, car elle peut être utilisée pour comparer la condition relative de différentes souches de V. cholerae ou les effets des mutations ou des knockouts génétiques.
1. Euthanasie
1. Lorsque l’expérience a atteint son point voulu, prélève un échantillon de l’eau d’infection (15 mL est généralement suffisant) pour permettre les décomptes bactériens excrétés et la mesure de la diarrhée (comme le test de mucine, la teneur en protéines et/ou la OD), si désiré.
2. Verse le reste de l’eau à travers un filet résille (pour recueillir les poissons) dans de l’eau de Javel pour tuer la V. cholerae dans l’eau.
3. Placez le poisson dans un bécher contenant de l’eau infectée plus 336 μg/mL d’éthyle 3-aminobenzoate méthanasole (tricaïne) et faites couver le poisson dans cette solution de tricaïne pendant 20 minutes à la réchauffe.
REMARQUE : Les résilles ont été stérilisées avec une solution d’eau de Javel à 10 %.
2. Dissection
1. Préparation du poisson
1. Extraire un poisson de la solution de tricaïne avec une cuillère en plastique jetable et le placer sur la surface de dissection.
2. Positionnez le poisson avec son côté ventral tourné vers le haut et épinglez-le à travers la mâchoire inférieure, l’extrémité émoussée de l’épingle étant inclinée loin du centre du corps. Placez une autre épingle juste derrière l’anus, également en angle opposé au corps.
2. Exposition du tube digestif
1. Prélever la surface ventrale du poisson avec une lingette sans peluches trempée dans 70 % d’éthanol.
2. Stériliser un scalpel et des ciseaux Vannas en les trempant dans 70 % d’éthanol et en les enflammant.
3. Faire une petite incision longitudinale dans le ventre, juste sous la peau, en pénétrant les écailles et en utilisant le scalpel. Faites attention à ne pas couper trop profondément, car le tube digestif se trouve juste sous la peau.
4. À l’aide des ciseaux, étendez soigneusement l’incision le long du corps, en ne coupant pas plus profondément que la peau et en évitant l’anus.
5. Effectuer deux coupures latérales avec les ciseaux vers la tête du poisson pour ouvrir l’incision.
6. Épingler la peau de chaque côté des incisions latérales à la surface de dissection, en inclinant les broches vers l’extérieur, loin du corps.
REMARQUE : Les extrémités des goupilles étaient auparavant stérilisées en les enflammant à l’alcool.
3. Ablation du tube digestif
REMARQUE : Le tube intestinal doit être visible sous forme d’un tube pâle et très fin sur les autres organes.
1. Stériliser les pinces à la flamme puis les utiliser pour retirer tout le tube intestinal (généralement de 12 à 15 mm de longueur). Placez l’intestin dans un tube d’homogénéisation contenant des billes de verre (voir les étapes 1.3.1–1.3.2) et 1 mL de 1x PBS ou LB, sur de la glace.
3. Homogénéisation
1. Préparez les tubes d’homogénéisation à l’avance en versant ~1,5 g de billes de verre de 1 mm dans des tubes à capuchon à vis de 2 mL (les remplir approximativement à mi-chemin) puis en les stérilisant par autoclavage.
2. Ajouter 1 mL de LB stérile ou 1x PBS.
3. Une fois les intestins de poisson-zèbre ajoutés (étape 1.2.3.1) aux tubes, visser les bouchons très fermement, puis fixer les tubes dans l’homogénéiseur vortex.
4. Homogénéisez les échantillons pendant 1 minute au réglage maximal, puis laissez-les refroidir sur de la glace pendant 1 à 2 minutes. Répétez ce cycle d’homogénéisation une fois de plus pour une homogénéisation complète. Note : Plusieurs méthodes alternatives d’homogénéisation fonctionneront également.
4. Quantification des niveaux de colonisation intestinale
1. Préparer des tubes (petits tubes à essai en verre ou microcentrifugeuses de 1,5 mL) pour la dilution en série de l’homogénéat en ajoutant 900 μL de LB ou 1x PBS à chaque tube. Pour chaque poisson, préparez 5 à 6 tubes et effectuez des dilutions en série de 10 fois de l’homogénate intestinale en ajoutant 100 μL d’homogénéat au premier tube, en le transformant pour le mélanger, puis en ajoutant 100 μL du premier tube au second tube.
2. Répétez cette procédure jusqu’à ce que toutes les dilutions soient prêtes.
3. Plaque 100–200 μL de chaque dilution sur des plaques d’agar LB contenant 100 μg/mL de streptomycine (si l’on utilise des souches résistantes à la streptomycine) et 40 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubez les plaques à 30 °C pendant 16 à 18 heures.
4. Après l’incubation nocturne, compter les colonies de V. cholerae sur les plaques, soit à l’aide d’un compteur automatisé de colonies, soit en comptant manuellement les colonies ; Il est utile de marquer les colonies comptées avec une pointe de marqueur.
5. Déterminer l’UFC par intestin de poisson en multipliant le nombre de plaques par le facteur de dilution de la suspension, en tenant compte du volume placé.