Colonisation intestinale et induction de diarrhée par Vibrio cholerae chez les poissons-zèbres adultes

Résumé

Source : Nag, D., et.al. Quantification de la colonisation de Vibrio cholerae et de la diarrhée dans le modèle du poisson-zèbre adulte. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre l’inoculation de poissons-zèbres adultes avec une souche pathogène de Vibrio cholerae afin d’étudier la colonisation intestinale et les issues de la maladie. Il montre comment les toxines bactériennes perturbent l’intégrité intestinale, entraînant des fuites de liquides, une sécrétion de mucus et une diarrhée aqueuse avant que les poissons ne soient préparés pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Inoculation du poisson-zèbre par immersion
   REMARQUE : Ce mode d’exposition ressemble au cours naturel de l’infection.
   1. Préparation du Vibrio cholerae
      1. Inoculez 5 mL de bouillon de lysogenèse (LB) avec une colonie isolée de V. cholerae à partir d’une plaque LB et couvez-la à 37 °C avec un secouage (180 tr/min) pendant 6 à 8 heures (culture nocturne).
      2. Inoculez 25 mL de milieu LB frais autoclavé dans un flasque conique de 250 mL avec 50 μL de la culture nocturne ci-dessus. Incubez-le pendant 16 à 18 heures à 37 °C avec secouage (150 tr/min).
      3. Lisez la densité optique à 600 nm (_{DO 600}) d’une dilution de 1/10 de la culture nocturne pour estimer le nombre de bactéries par mL (le_{DO 600} = 1 est ~10⁹ UFC/mL).
      4. Prélever les cellules par centrifugation à 6 000 g pendant 10 minutes. Retirez le média avec une pipette ou versez-le dans une solution désinfectante. Resuspendez les cellules dans un PBS stérile à la concentration souhaitée, généralement entre 1 x 10⁷ à 1 x^{10 10} par ml de PBS.
         REMARQUE : Ici, nous appelons l’eau d’infection stérile à l’eau d’osmose inverse autoclavée contenant 60 mg/L de sels marins.
   2. Inoculation et incubation
      1. Placez quatre ou cinq poissons-zèbres dans un bécher de 400 mL contenant 200 mL d’eau d’infection stérile.
      2. Ajoutez 1 mL de V. cholerae pour obtenir la concentration d’infection souhaitée (généralement 5 x 10⁴ à 5 x^{10 7} UAC/mL) dans 200 mL d’eau infectée.
      3. Couvrir le bécher d’un couvercle perforé pour empêcher le poisson de sauter ; le dessus d’une boîte à embout de 200 μL convient bien à cela.
      4. Étiquetez chaque bécher et placez-les dans un incubateur à façade vitrée placé à 28 °C pendant toute la durée de l’expérience.
   3. Procédure d’exposition transitoire
      REMARQUE : Une exposition transitoire à V. cholerae (généralement 6 h) suivie de l’élimination des bactéries inoculatrices est utile pour étudier la transmission et pour une quantification plus précise des bactéries excrétées.
      1. Après 6 heures d’exposition, versez l’eau du bécher à travers un filet résille pour recueillir les poissons. Jetez l’eau infectée dans un récipient d’eau de Javel pour tuer les V. cholerae.
      2. Placez les poissons retirés dans un bécher contenant 200 mL d’eau stérile d’infection. Laissez les poissons nager dans cette eau propre pendant 5 minutes pour éliminer les bactéries de surface.
      3. Répétez la procédure du filet et placez le poisson dans un nouveau bécher contenant 200 mL d’eau stérile d’infection. Gardez les poissons dans ce bécher pendant toute la durée de l’expérience.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Instrument
Incubateur	NUAIRE, Plymouth, MN	Flux automatique
Matériaux
Béchers en verre de 400 ml	Pyrex
Couvercles perforés	Porte-microembout avec trous provenant de la boîte à embouts
Système d’aquarium	Aquaneering, San Diego, CA
Purificateur d’eau en osmose inverse	Aqua FX	TK001
Filet de pêche	Marina
Nourriture pour poissons	Ailerne tétra
Plaque de Petri	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Tube centrifuge de 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Tubes à essai	Pyrex	9820
Micropipettes	Sartorius Biohit, Göttingen, Allemagne	M1000/M200/M20
Conseils	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Extrait de levure	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010