Évaluation de la perméabilité intestinale chez C. elegans après exposition bactérienne

Résumé

Source : Le, T. A. N. , et al., Mesurer les effets des bactéries et des substances chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente un test basé sur la fluorescence pour quantifier la perméabilité intestinale chez C. elegans exposée à Pseudomonas aeruginosa. Comparés aux témoins nourris avec Escherichia coli, les vers traités par agents pathogènes présentent une fuite accrue de fluorophores dans la cavité corporelle, indiquant des dommages à la barrière épithéliale.

Protocole

1. Préparation de plaques de milieu de croissance nématode (NGM) pour tester les effets de différentes bactéries sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans (C. elegans)

1. Placez 1,25 g de peptone, 1,5 g de NaCl, 8,5 g d’agar, un agitateur magnétique et 487,5 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre de 500 mL.
2. Mélangez bien le mélange, faites passer le mélange en autoclave pendant 15 minutes à 121 °C, puis refroidissez le mélange à 55 °C dans un bain-marie pendant 30 minutes.
3. Retirez le milieu du bain-marie, ajoutez les composants (0,5 mL de 1 M CaCl₂, 0,5 mL de cholestérol, 0,5 mL de_{MgSO 4}, 12,5 mL de KPO₄) au NGM, et mélangez bien.
   REMARQUE : Tous les composants individuels doivent être autoclavés sauf le cholestérol (dissous dans l’éthanol absolu), et chaque étape expérimentale doit être réalisée sur un établi propre.
4. Distribuez 20 mL de NGM dans chaque boîte de Petri de 90 x 15 mm et laissez l’agar solidifier sur un banc propre à température ambiante (environ 20 °C). Les plaques NGM peuvent être stockées jusqu’à un mois à 4 °C.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les plaques NGM utilisées pour la coloration FITC-dextran (Fluorescein isothiocyanate-dextran) ont été préparées. 10 mL de NGM ont été distribués dans chaque boîte de Petri de 60 x 15 mm et laissés solidifier sur un banc propre à température ambiante (environ 20 °C).
5. Retirez la culture bactérienne du réfrigérateur à 4 °C et faites passer la culture en vortex avant de la répartir sur les plaques NGM.
6. Ajoutez un total de 800 μL de la culture bactérienne à chaque plaque de GNM fraîche, puis laissez les plaques sécher dans un incubateur à 20 °C toute la nuit.
   REMARQUE : Pour la première expérience (Figure 1), deux plaques NGM contenant E. coli OP50, une plaque NGM avec P. aeruginosa PAO1, et une plaque NGM avec E. faecalis KCTC3206 ont été préparées. Pour la seconde expérience (Figure 2), deux plaques NGM avec E. coli vivant OP50, une plaque NGM avec P. aeruginosa vivant PAO1, et une plaque NGM avec P. aeruginosa PAO1 inactivée thermiquement ont été préparées.

3. Préparation de C. elegans synchronisés selon l’âge

1. Faites pousser des vers sur une plaque solide NGM et nourrissez-les avec E. coli OP50 jusqu’à atteindre la population désirée.
2. Synchronisez les œufs en utilisant soit la méthode de ponte chronométrée, soit le traitement à la solution de blanchiment

4. Traitement des bactéries et alimentation au FITC-dextran

1. Incubez les œufs synchronisés selon l’âge à 20 °C pendant 64 heures sur des plaques NGM complétées par de l’E. coli vivant OP50 comme nourriture.
2. Lavez les larves L4 synchronisées avec l’âge avec un tampon S et transférez-les (plus d’environ 500 vers) sur les plaques NGM de traitement contenant différentes bactéries et produits chimiques. Incubez-les à 20 °C pendant 48 heures.
   REMARQUE : Le temps de traitement peut varier de 24 à 72 heures, selon les bactéries et les produits chimiques utilisés. L’effet thérapeutique ou préventif du DIM peut également être évalué en pré-traitant les vers avec des agents pathogènes puis en les traitant avec le DIM (effet thérapeutique), ou en pré-traitant les vers avec le DIM puis en les traitant avec des agents pathogènes (effet préventif).
3. Pour préparer les plaques complétées en FITC-dextran, mélangez 2 mL d’E. coli OP50 inactivé par la chaleur avec 4 mg de FITC-dextran. Ensuite, divisez 100 μL du mélange FITC-dextran et E. coli OP50 en vingt plaques d’agar NGM fraîches (60 mm x 15 mm) et laissez sécher les plaques pendant 1 heure sur un établi propre.
   REMARQUE : La concentration finale de FITC-dextran dans chaque plaque NGM sera de 20 μg/mL.
4. Préparez cinq plaques NGM contenant de l’E. coli OP50 sans FITC-dextran pour le traitement de contrôle du véhicule. À cette fin, divisez 100 μL d’E. coli inactivé thermiquement OP50 sur chaque plaque d’agar NGM fraîche (60 mm x 15 mm) et laissez sécher les plaques pendant 1 heure sur un établi propre.
   REMARQUE : Pour chaque expérience indépendante, quinze plaques NGM complétées par FITC-dextran et cinq plaques NGM sans FITC-dextran sont requises.
5. Après 48 heures de traitement (de l’étape 7.2), lavez les vers avec du tampon S, transférez les vers vers sur les plaques renforcées en FITC-dextran et sur les plaques NGM sans FITC-dextran, puis incubez les plaques toute la nuit (14–15 h).
   REMARQUE : Pour chaque groupe de traitement, 5 répliques de coloration FITC-dextran (ou alimentation de contrôle du véhicule) sont requises.
6. Lavez les vers avec du tampon en S et laissez-les glisser dans la plaque d’agar NGM fraîche pendant 1 heure.
   REMARQUE : Pour chaque expérience indépendante, un total de 20 plaques NGM fraîches sont nécessaires. Dans cette étape, vous pouvez utiliser la plaque NGM complétée par ou sans E. coli OP50.
7. Ajoutez 50 μL de solution de formaldéhyde à 4 % à chaque puits d’une plaque noire à fond plat à 96 puits. Transférez environ 50 vers de chaque plaque NGM dans chaque puits pour des mesures de fluorescence. Après 1 à 2 minutes, retirez soigneusement tout le formaldéhyde de chaque puits et ajoutez 100 μL de médium de montage pour recouvrir les puits.
   REMARQUE : La solution de formaldéhyde (4 %) est utilisée pour immobiliser et fixer les vers. Pour chaque groupe de traitement, 5 puits (5 réplications) sont utilisés pour l’analyse d’image.

5. Imagerie de C. elegans avec le système d’imagerie opérette et détermination de la perméabilité intestinale par mesure de l’absorption de fluorescence FITC-dextran

REMARQUE : La stéréomicroscopie fluorescente peut être utilisée pour l’analyse d’images à la place du système Operetta.

1. Capturez des images de fluorescence et mesurez l’intensité de fluorescence à l’aide du système d’imagerie à haute teneur Operetta, puis analysez les images avec le logiciel Harmony.
2. Dans le logiciel Harmony, appuyez sur l’icône Ouvrir le couvercle pour ouvrir le couvercle et insérer la plaque dans la machine.
3. Établissez les paramètres.
4. Cliquez sur Installer, sélectionnez le type de plaque (Corning à fond plat à 96 puits), puis ajoutez les canaux (champ clair et canaux EGFP).
5. Ajustez la disposition. Allez dans la sélection de la disposition, puis sélectionnez Trajectoire et ajustez les paramètres (première image à 1 μm, nombre de plans à 10, distance à 1 μm).
6. Sélectionnez un des puits de traitement et un champ de capture et appuyez sur Test pour vérifier si les images sont satisfaisantes dans la section Run experiment .
7. Si les images sont satisfaisantes, retournez à la section Configuration et appuyez sur l’icône Réinitialiser en fin d’écran. Ensuite, sélectionnez tous les puits ciblés et un nombre approprié de champs de capture.
8. Va dans Lancer l’expérience à nouveau et saisi le nom de la plaque, puis appuie sur Start pour commencer le traitement.
9. Pour mesurer l’intensité de la fluorescence, allez dans la section analyse d’image et saisissez l’image. Trouvez la cellule en choisissant le canal EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) et la méthode B. Ajustez le seuil commun à 0,5, la surface à >200^{μm 2}, le facteur de division à 3,0, le seuil individuel à 0,18, et le contraste à plus de 0,18. Ensuite, on calcule les propriétés d’intensité et on choisit la moyenne comme sortie. Appuyez sur l’icône Appliquer pour sauvegarder la configuration.
10. Rendez-vous dans la section Évaluation pour mesurer l’intensité en obtenant une carte thermique et une table de données. Réglez le paramètre de lecture sur Cellules — Moyenne de la cellule d’intensité EGFP — Moyenne par puits et commencez l’évaluation.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
11. Pour extraire les données d’Operetta, cliquez sur le bouton Paramètres et choisissez Gestion des données.
12. Choisissez Écrire l’archive, puis ouvrez la navigation et sélectionnez le fichier.
13. Pour sélectionner le fichier, cliquez sur le petit + en coin gauche, puis cliquez sur Mesure et choisissez Nom de plaque.
14. Sélectionnez le fichier et cliquez sur OK.
15. Sélectionnez le chemin pour enregistrer le fichier en cliquant sur le signal Parcourir au chemin actif.
16. Cliquez sur Démarrer pour enregistrer le fichier de données.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

Résultats

Figure 1 : Les effets de différentes bactéries sur la perméabilité intestinale de C. elegans. Des images microscopiques des vers, incluant des images en champ clair, fluorescence FITC (canal vert) et images fusionnées...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de Petri de 90×15 mm	SPL Life Sciences, Corée du Sud	10090
Plaques de Petri de 60×15 mm	SPL Life Sciences, Corée du Sud	10060
Bactor Agar	Beckton Dickinson	RÉF. 214010
Solution de formaldéhyde	Sigma	F1635
Perfusion cerveau-cœur (BHI)	Becton Dickinson	RÉF. 237500
Caenorhabditis elegans N2	Centre de génétique Caenorhabditis (CGC)		Type sauvage
Plaque de test Costa, noire à 96 puits avec fond plat transparent non traité, polystyrène sans couvercle	Corning Incorporated	RÉF. 3631
Escherichia coli OP50	Centre de génétique Caenorhabditis (CGC)
Isothiocyanate de fluorescéine - dextran	Sigma	FD10S
Logiciel Harmony	PerkinElmer		Verson 3.5
Luria-Bertani LB medium	Merck	VM743185 626 1.10285.5000
Sulfate de magnésium heptahydré	Bioréactifs de Fisher	BP2213-1
Milieu de montage aqueux Fluoromount	Sigma	F4680
Système d’analyse à haut contenu Operetta CLS	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Collection coréenne pour la culture typographique	KCTC N° 1637
Chlorure de sodium	Bioréactifs de Fisher	BP358-1
Microscope stéréostérographique	Nikon, Japon	SMZ800N
Extrait de levure	Becton Dickinson	RÉF. 212750