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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de cultures de Salmonella Typhimurium ΔAroA pour le gavage oral de souris
- À partir d’un stock congelé de glycérol de S. Typhimurium ΔAroA, préparez une plaque de strie à l’aide d’agar Luria-Bertani (LB agar) contenant 100 μg/mL de streptomycine avec une boucle inoculante stérile. Incubez toute la nuit à 37 °C. Les plaques striées peuvent être conservées jusqu’à une semaine à 4 °C.
- Un jour avant l’infection, préparez l’antibiotique en dissolvant 0,5 g de streptomycine dans 2,5 mL d’eau. Après avoir filtré la solution de streptomycine, administrez les souris par voie orale à l’aide d’une aiguille à embout bulbique de 22G et d’une seringue de 1 mL avec 100 μL de solution de streptomycine (20 mg de streptomycine/dose). À l’aide d’une boucle inoculante, inoculez 3 mL de bouillon LB (50 μg/mL de streptomycine) dans un tube de culture avec une seule colonie. Incubez la Salmonella en aérobie à 37 °C pendant la nuit avec des secousses à 200 tours par minute (RPM).
- Le jour de l’infection, préparez la dose finale en effectuant 2 dilutions consécutives de 1/10 de cultures de Salmonella pendant la nuit dans une solution stérile de solution tampon phosphate (PBS). Cela aboutirait à un inoculum de 100 μL contenant environ 3 x 106 unités formatrices de colonies (UFC).
- À l’aide d’une aiguille de gavage de 22G à embout bulbeux et d’une seringue de 1 mL, faites passer chaque souris avec 100 μL de Salmonella préparée.
REMARQUE : Préparez des cultures de salmonelle en utilisant des techniques aseptiques. La concentration finale d’inoculation de Salmonella peut être vérifiée par des dilutions en série sur l’agar LB avec de la streptomycine.
2. Évaluation des charges de Salmonella dans les tissus
- Préparez des microtubes à fond rond à verrouillage de 2 mL avec 1 mL de PBS stérile et une bille en acier inoxydable autoclavé. Pesez les tubes avant la collecte des tissus.
- Réséquer les tissus cécals et splénique de souris euthanasiées par exposition au dioxyde de carbone. Collectez des tissus d’animaux individuels dans des tubes séparés. Pèse les tubes pour déterminer le poids des tissus.
- Homogénéisez à l’aide d’un appareil de broyeur mélangeur pendant 15 minutes à 30 Hz. Transférez 900 μL de PBS par puits dans un mégabloc de 96 puits de 2 mL. Pipeter 100 μL de tissu homogénéa dans le premier puits, mélanger bien et effectuer des dilutions en série en ajoutant 100 μL aux puits suivants jusqu’à obtenir une dilution de 10⁻⁶. Plaque de 10 μL de chaque dilution en triple sur AGAR LB contenant 100 μg/mL de streptomycine.
- Compter et multiplier la moyenne de l’UFC par un facteur de 100 puisque 10 μL de l’échantillon de 1000 μL ont été placés, et le facteur de dilution approprié. Divisez le poids total de l’UFC tissulaire par le poids tissulaire pour déterminer l’UFC par gramme de tissu.
REMARQUE : Conservez tous les échantillons sur la glace ou à 4 °C pendant le traitement des tissus. Utilisez des pointes de pipette à large orifice lors des dilutions en série avec des homogénates tissulaires. Préparez à l’avance le mégabloc de 96 puits contenant PBS.