Préparation de l’inoculum de Gardnerella vaginalis pour modéliser les infections urinaires récurrentes chez la souris

Résumé

Source : O’Brien, V.P. et al. Infection urinaire récurrente d’Escherichia coli déclenchée par l’exposition à la vessie vaginale à Gardnerella vaginalis chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la préparation d’un inoculum de Gardnerella vaginalis pour établir un modèle murin d’infection urinaire récurrente.

Protocole

1. Préparez l’inoculum de Gardnerella vaginalis
   REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées dans une chambre anaérobie. Les temps d’incubation idéaux en culture varient selon les souches de G. vaginalis, certaines souches entrant en phase stationnaire et commençant même à mourir plus rapidement que d’autres. Ainsi, les temps d’incubation doivent être déterminés empiriquement pour une souche donnée avant de réaliser des expériences sur des souris. On ignore si d’autres souches ou toutes de G. vaginalis déclencheront les mêmes effets dans ce modèle.
2. Streak G. vaginalis souche du bouillon congelé à -80 °C sur une assiette NYCIII (sans antibiotiques). Incubez la plaque à 37 °C anaérobie pendant 24 heures.
3. Dans la chambre anaérobie, inoculez 5 mL de milieu anaérobie NYCIII avec une boucle de cellules de 1 μL (une seule colonie est insuffisante) de la plaque NYCIII et incubez en culture statique à 37 °C dans des conditions anaérobies pendant 18 heures. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu de croissance.
4. Déterminez le OD⁶⁰⁰ de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre
   1. Centrifugez un volume défini (X) de culture à 9600 × g pendant 1 minute et aspirez le milieu. Calculez le volume (Y) de solution saline tamponnée phosphate (PBS) pour resuspendre le pellet afin d’atteindre la densité optique (OD) de l’inocule souhaitée et obtenir 10⁸ unités formant des colonies (UFC) en 50 μL en utilisant l’équation suivante : X mL × ODculture = Y mL × ^inoculum OD, résoudre pour YY = (X ml × ODculture) / ^{OD inoculum}
      REMARQUE : ^L’inoculum OD pour JCP8151B^SmR est de 5, mais cela doit être déterminé empiriquement pour les autres souches de G. vaginalis. Par exemple, si vous faites tourner 3 mL d’une JCP8151B^SmR pendant la nuit avec ODculture = 2,0 : Y = (3 mL × 2,0) / 5,0 ; par conséquent, resuspendre le projectile dans un PBS de 1,2 mL.
   2. Resuspendez la granule bactérienne dans le PBS à la concentration souhaitée. Diluez et placez l’inoculum en série pour déterminer la dose réelle utilisée dans chaque expérience. Ne vous fiez pas uniquement aux valeurs OD.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glucose	Sigma	G7528	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
4-(2-hydroxyéthyle)-1-piperazine, acide éthanassulfuronique (HEPES)	Cellgro	25-060-Cl	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Chlorure de sodium	Sigma	S3014	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Peptone protéose #3	Fisher	DF-122-17-4	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Extrait de levure	Fisher	DF0127-17-9	Pour le milieu de croissance de G. vaginalis NYCIII
Spectrophotomètre	BioChrom	80-3000-45	Mesure de la bactérie OD600
Strepttomycine	Gibco	11860038	Ajouter à G. vaginalis les plaques sélectives NYCIII (1 mg/mL)