Génération d’une monocouche colonoïde humaine avec fonction barrière pour étudier les interactions hôte-pathogène

Résumé

Source : In, J. G., et al. Monocouches de colonoïdes humaines pour étudier les interactions entre agents pathogènes, commensaux et épithélium intestinal de l’hôte. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo illustre la procédure de culture de cellules épithéliales dérivées du côlon sur un système Transwell recouvert de collagène afin de générer une monocouche productrice de mucus qui modélise la barrière intestinale et permet des études d’interaction hôte-pathogène.

Protocole

1. Plaquage de la suspension entéroïde/colonoïde

1. Si les inserts revêtus étaient stockés à 4 °C, équilibrez-les dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C/5 % de_CO-2 pendant au moins 30 minutes avant le plaque cellulaire.
2. Pour chaque insert à plaquer, préparez 1 mL de milieu d’expansion tiède (entre 25 et 37 °C) et ajoutez 10 μM Y-27632 et 10 μM CHIR 99021.
   REMARQUE : L’EM est composé de DMEM avancé (milieu Eagle modifié de Dulbecco) /F12 contenant B27 (1x), 50 % de milieu conditionné WNT3A, 15 % de milieu conditionné par RSPO1, 10 % de milieu conditionné Noggin, 50 ng/mL d’EGF humain (facteur de croissance épidermique), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, cocktail antibiotique/antimycotique (1x), 10 mM HEPES (N-(2-Hydroxyéthyl)piperazine-N'-(acide 2-éthanassulfonique)), Dipeptide L-alanyl-L-glutamine (1x), et pénicilline-streptomycine (1x) (voir Tableau des matériaux).
3. Aspirez le milieu de lavage du tube contenant la pellete cellulaire et resuspendez dans un volume d’EM suffisant pour obtenir au moins 100 μL/insert.
4. Aspirez la solution IV de collagène de chaque insert et lavez deux fois avec 150 μL du substrat par insert.
5. Pipeter 600 μL d’EM dans l’espace sous chaque insert.
6. Pipeter 100 μL de suspension cellulaire dans chaque insert.
7. Retournez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et laissez la laisser intacte pendant au moins 12 heures.
   REMARQUE : Évitez de secouer ou d’incliner brusquement la plaque pour éviter une répartition inégale des fragments de colonoïde sur la membrane insérée.
8. Surveillez l’attachement cellulaire et la propagation pour former une monocouche confluente en plaçant la plaque sur un microscope optique à contraste de phase sous une lentille objective 2,5x-10x.
9. Après 1 à 2 jours, la plupart des fragments devraient adhérer à la matrice de collagène. Renouvelez le milieu de culture et arrêtez le traitement avec Y-27632 et CHIR 99021. Continuez à rafraîchir le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que le confluent soit maintenu. La confluence est généralement atteinte en 7 à 10 jours.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Base tris, composant du tampon de lyse
A-83-01	Tocris	2939	Inhibiteur d’ALK4/5/7
Acide acétique, glaciaire	Fisher Scientific	A38
DMEM avancé/F12	Technologies de vie	12634-010	Composant du milieu de croissance
Cocktail antibiotique/antimycotique	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Technologies de vie	17504-044	Composant du milieu de croissance
Inserts de culture cellulaire	Corning	3470	Transwell, membrane PET, pore 0,4 μm, plaque à 24 puits
CHIR 99021	Tocris	4423	Inhibiteur GSK3β
Collagène IV, issu du placenta humain	Sigma	C5533
Solution de récolte d’organoïdes Cultrex	Trevigen	3700-100-01	Dépolymérise la matrice membranaire basale
Éthanol, absolu	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Technologies de vie	35050-061	Dipeptide L-alanyl-L-glutamine, 200 mM
HEK293T/Lignée cellulaire Noggin-Fc	laboratoire van den Brink, Institut Tytgat de recherche hépatique et intestinale		Pour la production de milieu conditionné à Noggin
HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Trevigen	3710-001-K	Pour la production d’un milieu conditionné Rspondin-1
HEPES, 1 M	Technologies de vie	15630-080	Composant du milieu de croissance
Facteur de croissance épidermique humain (EGF)	Systèmes de R&D	236-EG-01M	Composant du milieu de croissance
Microscope lumineux inversé de culture cellulaire	Olympe	CKX51
Lignée cellulaire L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Pour la production de milieu conditionné Wnt3a
Matrigel, facteur de croissance réduit	Corning	356231	Matrice membranaire de socle pour la culture 3D
Racleur à mini-cellules	United BioSystems	MCS-200
Anticorps MUC2, monoclonal de souris	Abcam	ab11197	À utiliser à 1:100 pour l’immunocoloration, 1:500 pour l’immunoblotting
Particules lentivirales de SHRNA MUC2	GE Dharmacon	RHS4531	ARNh lentiviral GIPZ, ID : 4583
Secoueur orbital	Instruments de subvention	Alimentation alimentation 10i
Pénicilline-streptomycine, 100x	Technologies de vie	15140-122	Composant du milieu de croissance
Sonateur sonde avec micro-pointe	Branson Ultrasonics	450
Cocktail inhibiteur de protéase pour cellules mammifères	Sigma	P8340	Composant du tampon de lyse
SB 202190	Tocris	1264	Inhibiteur p38 MAPK
Chlorure de sodium	Sigma	S3014	Composant du tampon de lyse
Dexoycholate de sodium	Sigma	D6750	Composant du tampon de lyse
Dodécyle sulfate de sodium	Sigma	L3771	Composant du tampon de lyse
TrypLE Express, 1x	Technologies de vie	12605-010	La trypsine pour digérer les fragments d’entéroïdes/colonoïdes
Anticorps de vinculine, monoclonal de lapin	Abcam	ab129002	À utiliser à 1:1000 pour l’immunoblotting
Eau, culture tissulaire, filtration stérile	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inhibiteur RhoA/ROCK