Génération de sphéroplastes à partir de bactéries à Gram négatif

Résumé

Source : Figueroa, D. et al. Production et visualisation de sphéroplastes et protoplastes bactériens pour caractériser la localisation des peptides antimicrobiens. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la préparation des sphéroplastes à partir de bactéries à Gram négatif en forme de bâtonnet. Les bactéries se développent en présence d’un antibiotique pour former des filaments allongés. Ces derniers sont lavés avec une solution hypertonique et traités avec un tampon de lyse pour retirer la paroi cellulaire externe. Le traitement hypotonique forme des sphéroplastes, qui sont stabilisés avec une solution isotonique refroidie et stockés dans des conditions froides.

Protocole

1. Préparation de la solution

REMARQUE : Préparez les solutions décrites aux étapes 1.1–1.9 afin de produire des sphéroplastes d’Escherichia coli (E. coli )

1. Préparez 1 M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane hydrochlorure (Tris-Cl), pH 7,8 en dissolvant 10,34 g de Tris·HCl et 4,17 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris·OH) dans 50 mL d’eau distillée (dH₂O) dans un flasque de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
2. Préparez la solution A (20 mM de chlorure de magnésium (MgCl₂), 0,7 M de saccharole, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,10 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) et 11,98 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 25 mL de dH₂O dans une fiole de 125 mL. Ajoutez 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et ajustez le volume à 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
3. Préparez la solution B (10 mM MgCl₂, 0,8 M de sacchaline, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,05 g de MgCl₂ (95,2 g/mol) et 13,69 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 25 mL de dH₂O dans une fiole de 125 mL. Ajoutez 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et ajustez le volume à 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
4. Préparez 0,8 M de saccharose en dissolvant 13,69 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 50 mL dH₂O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
5. Préparez 5 mg/mL de désoxyribonucléase I (DNase I) en dissolvant 0,015 g de DNase I dans 3 mL de dH₂O dans un flasque de 50 mL. Stérilisez en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm. Solution aliquote dans des tubes microfuge et stockée à −20 °C.
6. Préparez 0,125 M d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0, en dissolvant 0,698 g de dihydre disodium EDTA (372,2 g/mol) en 15 mL dH₂O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
7. Préparez 600 μg/mL de céphalexine en dissolvant 0,03 g d’hydrate de céphalexine (365,404 g/mol) dans 50 mL de dH₂O dans une fiole de 125 mL. Stérilisez en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conservez dans un tube conique à 4 °C.
8. Préparez 5 mg/mL de lysozyme en dissolvant 0,015 g de lysozyme dans 3 mL de dH₂O dans une fiole de 50 mL. Stérilisez en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm. Solution aliquote dans des tubes microfuge et stockée à −20 °C.
9. Préparez 3 % avec bouillon de soja trypticase (TSB) en dissolvant 30 g de TSB dans 1 L de dH₂O dans une flasque de 2 L. Aliquote la solution dans des flasques contenant 25 mL ou 100 mL de TSB destinées à être utilisées dans la préparation des sphéroplastes d’E. coli ou des protoplastes de B. megaterium, respectivement. Des flasques d’autoclave pour stériliser le milieu liquide. Le TSB stérile peut être conservé à température ambiante ou à 4 °C.
10. Préparez la solution C (1 M de saccharose, 0,04 M de maléat, 0,04 M de MgCl₂, pH 6,5) en dissolvant 34,23 g de saccharose (342,3 g/mol), 0,46 g d’acide maléique (116,07 g/mol) et 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) dans 100 mL de dH₂O dans une fiole de 250 mL. Ajustez le pH à 6,5. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.

2. Préparation de la culture nocturne

REMARQUE : Effectuez les sections 2 à 3 en utilisant des techniques stériles appropriées. Si désiré, une souche bactérienne peut contenir un plasmide pour la résistance aux antibiotiques afin de réduire la contamination potentielle. Si vous utilisez une souche résistante aux antibiotiques, ajoutez les antibiotiques nécessaires aux étapes 2.1 et 3.1–3.2.

1. Préparez une culture toute la nuit en prélevant une colonie unique de bactéries à l’aide d’une pointe de pipette stérile et en la plaçant dans un tube de culture de 14 mL contenant 2 à 3 mL de 3 % à 3 % à 3 % de TSB. Incuber à 37 °C, tout en secouant pendant 16 à 21 heures.

3. Préparation des sphéroplastes à E. coli à Gram négatif

1. Dans une fiole de 250 mL, diluez la culture nocturne à 1:100 dans un volume de 25 mL de 3 % de TSB à 3 % w/v et incubez la solution bactérienne à 37 °C, tout en secouant pendant environ 2,5 h jusqu’à ce que la solution atteigne une densité optique de 0,5–0,8 à 600 nm. Mesurez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Dans une fiole de 250 mL, diluez cette culture 1:10 dans 30 mL de 3 % de TSB à 3 % en po/v et incubez à 37 °C, tout en secouant pendant 2,5 h en présence de 60 μg/mL de céphalesine (347,4 g/mol) pour produire des filaments monocellulaires d’environ 50 à 150 μm de long, observables sous un grossissement de 1 000X au microscope optique (Figure 1B).
3. Récoltez les filaments en centrifugant la solution bactérienne à 1 500 x g, 4 °C pendant 4 minutes. Décantez et jetez le surnageant, en réservant la pastille.
4. Lavez les filaments en ajoutant doucement 1 mL de saccharose à 0,8 M, en faisant attention à ne pas déranger la pellete. Incubez pendant 1 minute, puis jetez le surnageant sans déranger la pellete.
5. Ajoutez 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL de lysozyme à 5 mg/mL, 30 μL de 5 mg/mL de DNase I et 120 μL de 0,125 M EDTA dans leur ordre respectif dans le pellet, puis faites couver la solution à température ambiante pendant 10 minutes.
6. Ajoutez progressivement 1 mL de solution A pendant 1 minute à la solution préparée en 3,5 à l’aide d’une micropipette tout en faisant doucement tourner la solution à la main. Incubez la solution pendant 4 minutes à température ambiante.
7. Mettez 7 mL de solution B à 4 °C dans deux tubes coniques de 15 mL. Ajoutez des quantités égales de la solution préparée en 3,6 à chacun de ces deux tubes. Centrifugez la solution à 1 500 x g, 4 °C pendant 4 minutes.
8. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement tout sauf 1 à 2 mL de surnageant sans déranger la granule. Résuspendez la pellete en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1000. Vérifiez visuellement la formation des sphéroplastes en observant l’échantillon à un grossissement de 1 000 fois à l’aide d’un microscope optique (Figure 1C).
9. Conservez les sphéroplastes à -20 °C pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’ils aient traversé 3 cycles de congélation-dégel.

Résultats

Figure 1 : Images représentatives d’Escherichia coli. (A) la bactérie E. coli , (B) le serpent E. coli, et (C) le sphéroplaste d’E. coli. Les images ont été prises à un grossisse...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trizma hydrochlorure (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Chlorure de magnésium	Sigma	M8266
Saccharose	Sigma	S7903
Lysozyme	Sigma	L6876
Désoxyribonucléase I	Sigma	D4527
Acide éthylédiaminétique tétraacétique	Sigma	106361	A utilisé Sigma 106361 dans le développement original du protocole ; 106361 arrêté avec l’ED2SS en remplacement
Céphalexine hydrate	Sigma	C4895
Bouillon de soja BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Acide maléique	Sigma	M0375
Filtre à seringue Acrodisc 25 mm avec membrane HT Tuffryn de 0,2 μm	Pall Corporation	4192