Établissement d’un modèle murin d’infection vaginale du groupe B par Streptococcus

Résumé

Source : Patras, K. A., Doran, K. S. Un modèle murin de colonisation vaginale du groupe B de Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la préparation et l’inoculation vaginale d’une souris femelle traitée aux hormones et une sreptocoque du groupe B pour modéliser l’infection. Il explique comment cultiver et préparer les bactéries, administrer l’inoculum dans la lumière vaginale et garantir le succès de l’infection.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité local de soins aux animaux institutionnels et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation vaginale avec le Streptocoque du groupe B (SGB)

1. Un jour avant l’inoculation, cultivez une culture liquide de 5 ml pendant la nuit d’une souche de GBS d’intérêt, telle que A909 (sérotype Ia), dans un bouillon Todd Hewitt (THB) à 37 °C.
2. Sous-culture du GBS en culture nocturne à un volume 1:10 en THB frais et incuber à 37 °C. Faire pousser la bactérie jusqu’à la phase mi-logarithmique (OD₆₀₀ = 0,4-0,5).

REMARQUE : Cela prend généralement 2 à 3 heures, selon la tension du GBS.

3. Transférez la sous-culture dans un tube conique stérile de 15 ml et faites des granules à 3 000 × g pendant 5 minutes. Aspirez le surnageant. Résuspendez la pellete bactérienne dans 200 μl de solution stérile tamponnée phosphate (PBS).
4. À l’aide du pellet en suspension réintégré, apportez 3 à 5 ml de PBS (1 ml pour 10 souris) à exactement₆₀₀ = 0,4 dans un nouveau tube de culture de 5 ml. Cela correspondra à une concentration de ~ 1 × 10⁸ unités formant colonies (UFC)/ml. Transférez dans un nouveau tube conique de 15 ml et réinjectez les bactéries à 3 000 × g pendant 5 minutes. Aspirez le surnageant.
5. Résuspendez le pellet en PBS à 1/10 du volume initial. Par exemple, si 3 ml de OD₆₀₀ = 0,4 ont été comprimés, alors resuspendez-les dans 300 μl de PBS.

REMARQUE : Il s’agit de la dernière suspension bactérienne (~ 1 × 10⁹ UFC/ml) utilisée pour l’inoculation animale.

6. Réservez 50 μl de cette suspension pour la dilution en série et le plaquage sur l’agar THB afin de déterminer l’inocule exact.
7. Inoculez chaque souris avec 10 μl de la suspension bactérienne finale afin qu'1 × 10^{7 UFC} soient administrées à chaque souris.
   1. Pour vacciner, attachez manuellement la souris en fixant la peau lâche au niveau du col du cou entre le pouce et l’index du maître, puis en immobilisant la queue.
   2. Extraire 10 μl de GBS dans une pointe de pipette à chargement gel de 200 μl. Insérez la pointe de 5 à 10 mm dans la lumière vaginale et dispensez les 10 μl d’inocule.
      REMARQUE : Les embouts à charge en gel sont préférés aux embouts standards de 200 μl afin de minimiser le risque de traumatisme ou de blessure d’organe, en particulier chez les souris plus jeunes ou plus petites.
   3. Immédiatement après l’inoculation, relâchez la peau du cou et soulève l’arrière de la souris, soulevez la souris par la queue et marchez les pattes avant sur une surface dure pendant ~ 1 minute.
   4. Inspectez visuellement l’ouverture vaginale pour détecter tout reflux d’inoculum. Si un reflux est observé, une pointe de pipette fraîche peut être utilisée pour manipuler ou agrandir l’ouverture vaginale, facilitant ainsi l’absorption du reflux dans la lumière. De plus, le reflux peut être aspiré par pipette et re-inoculé.
      REMARQUE : Si l’administration d’agents topiques, d’organismes probiotiques ou de protéines d’intérêt, un volume pouvant aller jusqu’à 20 μl dans un tampon physiologique peut être administré dans le tube vaginal.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Embouts de pipette à chargement gel de 200 μl	USA Scientific	1252-0610
Bouillon Todd Hewitt	Hardy Diagnostics	7161C
Solution de sel tamponné phosphate de Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV