Quantification de la suppression du biofilm induite par les enzymes chez les bactéries pathogènes

Résumé

Source : Tay, S. B., et al. Perturbation antivirulente des biofilms pathogènes utilisant des lactonases modifiées pour l’extinction du quorum. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo démontre une méthode pour quantifier la biomasse de biofilm dans une bactérie pathogène, en comparant des témoins non traités à des échantillons traités avec une enzyme quorum-quenching. L’enzyme perturbe la signalisation bactérienne lors de l’incubation précoce, réduisant l’adhésion cellulaire. Après lavage et incubation supplémentaire, les puits de contrôle forment des biofilms denses, tandis que les puits traités présentent une formation réduite. Un colorant cationique est utilisé pour colorer le biofilm, et l’absorbance est mesurée pour évaluer la biomasse.

Protocole

1. Quantification violette cristalline de la formation de biofilms chez A. baumannii S1

1. Cultivez une culture de 5 mL d’Acinetobacter baumannii S1 (A. baumannii) dans un bouillon de lysogenèse (LB) (tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L) à 30 °C dans un incubateur secoué (220 tr/min) pendant 16 heures.
2. Ajustez la culture d’A. baumannii S1 à une densité optique désirée à 600 nm (OD₆₀₀) de 0,8. À l’aide d’une plaque à 96 puits, inoculez la culture bactérienne (dilution 1:100) dans du LB frais contenant 10 μl d’enzyme GKL purifiée (40 mg/ml) ; Le volume final de la nouvelle culture fait 100 μl.
3. Préparez également une culture de contrôle ; Cela ne contiendra aucune enzyme. Répétez des conditions similaires pour obtenir le nombre désiré de répliques.
4. Couvrez l’assiette avec un couvercle et placez-la dans un contenant plastique scellé de 10 L. Incubez la plaque à 30 °C pendant 3 heures avant de retirer doucement le substrat.
5. Ajoutez encore 100 μl de médium libre de livres fraîches au puits et faites couver la plaque pendant 21 heures à 30 °C.
6. Après la deuxième période d’incubation, retirez doucement tout le substrat. Lavez la cellule bactérienne planctonique avec de l’eau stérile à 200 μl. Veillez à ce qu’il y ait un minimum de perturbation des cellules lors du lavage.
7. Ajoutez 100 μl de solution de violet cristalline à 1 % dans chaque puits et faites couver pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez la solution de violet cristallin en lavant le puits avec de l’eau stérile de 200 μl. Répétez le lavage deux fois de plus.
8. Ajoutez 100 μl d’acide acétique à 33 % dans chaque puits et faites couver pendant 15 minutes avec un léger secouement ; Cela dissoudra la teinture.
9. Quantifier la quantité de biofilm formée en mesurant l’absorption de la violette cristalline à 600 nm. La quantité de violet cristal est proportionnelle à la quantité de biofilm formée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tryptone	BD	211705
Extrait de levure	BD	212750
Plaque à 96 puits	Partenaire	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acide acétique	Scan de laboratoire	PLA00654X	Attention : Inflammable
Lecteur de microplaques Synergy HT	BioTek