1. Microscopie laser confocale du biofilm S1 d’A. baumannii
1. Cultiver une culture de 5 ml d’A. baumannii S1 en LB à 30 °C dans un incubateur secoué (220 tr/min) pendant 16 heures.
2. Ajuster la culture d’A. baumannii S1 à un ODsouhaité de 600 de 0,8. À l’aide d’un μ-Dish à fond en verre de 35 mm, inoculez la culture bactérienne (dilution 1:100) dans du LB frais contenant 30 μl d’enzyme GKL purifiée (40 mg/ml) ; Le dernier volume de The New Culture fait 1 ML.
3. Couvrir le μ-plat d’un couvercle et le placer dans un contenant plastique scellé de 10 L. Incubez le μ-Plat à 30 °C pendant 3 heures avant de retirer doucement le substrat. Ajoutez 30 μl d’enzyme GKL purifiée et un milieu frais, pour atteindre un volume total de 1 ml. Incubez encore 21 heures à 30 °C.
4. Répétez l’étape 1.3 et incubez le μ-Bowl pendant encore 24 heures à 30 °C. Ensuite, retirez doucement le support.
5. Ajouter 500 μl d’agglutinine germinale de blé conjuguée Alex Fluo 488 (WGA) de 5 μg/ml dissoute dans la solution salée équilibrée de Hank (HBSS) dans le μDish et incuber à 37 °C pendant 30 minutes ; Cela colorera le biofilm formé. Enlevez la solution de tache et lavez le μ-Plat avec 2 ml de HBSS. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.
6. Ajouter 500 μl de formaldéhyde dissous à 3,7 % dans le HBSS et incuber à 37 °C pendant 30 minutes ; cela fixera le biofilm sur la μ-Dish. Lavez la mâche une fois avec 2 ml de HBSS puis retirez complètement la solution. Le μ-Antenne fixé avec un biofilm peut être stocké dans l’obscurité à 4 °C avant l’imagerie CLSM.
7. Pour l’imagerie et l’analyse CLSM, utiliser un grossissement de 63 fois pour générer 97 piles par image avec un intervalle de 0,21 μm par pile.
