Détection des saccharibactéries en culture binaire utilisant la réaction en chaîne par polymérase

Résumé

Source : Collins, A. J., et al., Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques à partir de la cavité orale. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour détecter les saccharibactéries dans une culture binaire avec des Actinomyces. Le protocole décrit l’amplification de l’ADN et l’électrophorèse sur gel afin de confirmer une interaction stable hôte-parasite.

Protocole

1. Confirmer l’infection aux saccharibactéries par PCR
   1. Après 5 passages, confirmez l’infection par la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cinq passages garantiront que toutes les cellules de Saccharibacteria non en croissance ont été épuisées au-delà de la limite de détection à l’aide de 25 cycles de PCR.
   2. Préparez un master mix PCR. Voici une recette suggérée : pour chaque tube nécessaire, préparer 12,5 μL de tampon PCR 2x, 0,75 μL 10 μM amorce directe (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM amorce inversée (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM_{MgCl 2, et 9} μL d’eau. Mélange par vortex.
   3. 24 μL de mélange maître dans un tube PCR de 0,2 mL. Ajoutez 1 μL de culture infectée par des saccharibactéries à la réaction PCR. Placez le tube dans un thermocycleur et exécutez le protocole suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 minutes, 25 cycles à 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, allongement final à 72 °C pendant 2 minutes, puis maintien final à 4 °C.
   4. Chargez et faites fonctionner les produits PCR dans un gel d’agarose à 1 %. Une bande de ~600 bases indiquera la présence de Saccharibacteria.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Bouillon d’infusion Brain Heart (poudre déshydratée)	Becton-Dickinson	211059	Ou d’autres milieux de croissance adaptés aux organismes cibles
Alimentation électrique par électrophorèse	Bio-Rad	1645052
Équipement d’électrophorèse	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Ou un thermocycleur équivalent pour la PCR
Solution MgCl₂ 25mM	Promega	A3513
Eau de qualité biologie moléculaire	Fisher Scientific	BP2819100
Micropipette P-1000	Gilson	F123601G
Tubes PCR 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Pointes de pipette - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Coloration en gel ADN sûre SYBR	ThermoFisher Scientific	S33102
Bouillon de soja tryptique (poudre déshydratée)	Becton-Dickinson	211825	Ou d’autres milieux de croissance adaptés aux organismes cibles