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REMARQUE : Pendant toute l’expérience, les cellules de macrophages sont incubées à 37 °C dans un incubateur à air forcé à 5 % deCO2 et retirées de l’incubateur uniquement pour des manipulations expérimentales, réalisées dans un cabinet de sécurité biologique de classe II. Travailler avec la bactérie Listeria monocytogenes est conforme aux réglementations de niveau 2 de sécurité biologique.
1. Préparation cellulaire et infection bactérienne (jours 1 et 2)
- Jour 1
- Semez 2,0 x10 cellules macrophages dérivées de la moelle osseuse (BMDM) sur un plat de 145 mm dans un milieu de 30 ml de BMDM + Pen-strep (Tableau 2). Semez 3 plaques pour chaque souche bactérienne à analyser. Incubez toute la nuit à 37 °C dans un incubateur à air forcé à 5 % de CO2 .
- Commencez une culture bactérienne nocturne de la souche sauvage de L. monocytogenes 10403S dans 10 ml de milieu d’infusion cérébrale (BHI), à 30 °C, dans un incubateur standard. Placez les tubes de culture inclinés sans secousses.
REMARQUE : Ces conditions de croissance régulent à l’excès l’expression des gènes des flagelles, ce qui favorise une infection efficace.
- Jour 2
- Milieu BMDM pré-chaud (sans antibiotiques Pen-Strep) (Tableau 2) et solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) à 37 °C.
- Lavez deux fois la monocouche de macrophage avec 25 ml de PBS pré-chauffé pour retirer les antibiotiques. Ajoutez 30 ml de substrat BMDM frais.
- Lavez 1,5 ml de culture bactérienne pendant la nuit avec du PBS en centrifugant les bactéries à > 14 000 x g pendant 1 minute, en éliminant le surnageant, puis en resuspendant doucement les bactéries dans 1,5 ml de PBS par pipetage. Répétez deux fois.
- Infecter chaque plaque macrophage avec 0,5 ml d’une culture lavée de type L. monocytogenes sauvage pendant la nuit. Si vous utilisez plusieurs assiettes, infectez chaque assiette à 15 minutes d’intervalle. Cet intervalle de temps permettra de prélever chaque plaque individuellement à la fin de l’infection.
REMARQUE : La multiplicité de l’infection (MOI) est évaluée en placant les dilutions sérielles de cultures bactériennes utilisées pour l’infection sur les plaques d’agar BHI et en comptant les unités formatrices de colonies (UFC) après une incubation de 24 heures des plaques à 37 °C. L’utilisation de 0,5 ml de WT L. monocytogenes souche 10403S donne un MOI de ~ 100 (100 UFC bactériennes par cellule macrophage). Lors de l’analyse des mutants bactériens défectueux dans la croissance intracellulaire, un MOI plus élevé doit être pris en compte. - Après une incubation de 0,5 h à 37 °C, lavez deux fois les cellules infectées avec du PBS pour éliminer les bactéries non attachées, puis ajoutez 30 ml de substrat BMDM préchauffé. Les bactéries attachées s’intérioriseront pendant les 0,5 heures suivantes.
- À 1 heure après l’infection, ajoutez 30 μl de gentamicine (1:1 000 pour atteindre une concentration finale de 50 μg/ml) afin de tuer les bactéries extracellulaires.
- Montez l’appareil filtrant en plaçant une tête filtrante sur une fiole de liquide collecteur avec un port de sortie sous vide. Ensuite, placez un filtre (0,45 μm) sur une tête filtrante, suivi d’un entonnoir cylindrique, et fixez les différentes pièces avec une colle-serre métallique. Préparez de l’eau glacée sans RNase.
- 6 heures après l’infection, prélever les bactéries des cellules infectées comme suit. Traitez chaque assiette individuellement.
REMARQUE : Habituellement, L. monocytogenes complète 1 log de croissance pendant 6 heures d’infection dans les cellules macrophages. Des incubations plus longues pourraient entraîner une prolifération bactérienne et la mort cellulaire des macrophages, tandis que des périodes d’incubation plus courtes pourraient entraîner des charges bactériennes considérablement plus faibles. Le MOI et le moment de l’infection peuvent être modifiés pour atteindre des conditions optimales.- Lavez les cellules infectées avec du PBS une fois. Ajoutez 20 ml d’eau froide sans RNase pour lyser les cellules macrophages. À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez rapidement mais soigneusement les cellules de la plaque.
- Collectez les cellules lysées dans un tube conique de 50 ml. Vortex pendant 30 secondes. Centrifugez à 800 x g pendant 3 minutes à 4 °C.
- Faites passer le surnageant à travers l’appareil filtrant à l’aide d’un système à vide. À l’aide d’une pince à épiler, roulez le filtre et transférez-le rapidement dans un tube conique de 15 ml. Congelez brusquement les tubes avec les filtres dans de l’azote liquide.
- Assemblez l’appareil de filtration avec un nouveau filtre pour l’échantillon suivant, comme décrit dans la 1.2.7.
- Conservez les filtres gelés à -80 °C pour le lendemain. Sinon, procéder directement à l’extraction des acides nucléiques.
Tableau 1 : Protocole de réaction DNase.
| ARN | jusqu’à 2 μg (en volume maximal de 44 μl) |
| Tampon DNase 10x | 5 μl |
| Eau sans RNase | Complet à 50 μL en volume total |
| DNAse | 1 μl (1 unité) |
Tableau 2 : Recettes de médias et de tampons.
| 1. 500 ml de substrat BMDM+Pen-strep (Stérilisé par filtre) : | |
| Eagle Medium Modifié (DMEM) de Dulbecco | 235 ml |
| Sérum bovin fœtal (FBS) (inactivé 30 min à 54 °C) | 100 ml |
| Facteur stimulant la colonie de macrophages ou M-CSF (milieu conditionné L-929) | 150 ml |
| Glutamine | 5 ml |
| Pyruvate de sodium | 5 ml |
| β-Mercaptoéthanol | 0,5 ml |
| Pénicilline/Streptomycine | 5 ml |
| Total | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (stérilisé par filtre) : | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inactivé 30 min à 54 °C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 moyen conditionné) | 150 ml |
| Glutamine | 5 ml |
| Pyruvate de sodium | 5 ml |
| β-Mercaptoéthanol | 0,5 ml |
| Total | 500 ml |
| 3. Tampon AE | |
| Acétate de sodium (NaOAc) pH 5,2 | 50 mM |
| Acide éthylédiamine tétraacétique (EDTA) | 10 mM |
| Eau sans RNase | |
| 4. phénol-chloroforme-IAA | |
| Phénol | 25 ml |
| Chloroforme | 24 ml |
| Alcool iso-amyl | 1 ml |
| 5. chloroforme-IAA | |
| Chloroforme | 24 ml |
| Alcool iso-amyl | 1 ml |