Extraction d’ARN à partir de Listeria monocytogenes prélevée sur des macrophages murines infectés

Résumé

Source : Sigal, N., et al. Purification de l’ARN à partir de Listeria monocytogenes cultivée intracellulairement dans des cellules macrophages. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’extraction d’ARN à partir de Listeria monocytogenes isolée sur des macrophages murins infectés. Le protocole préserve l’ARN, lyse les cellules à l’aide du phénol-chloroforme et de la chaleur, et sépare l’ARN par centrifugation. Le sel et l’éthanol, combinés à l’incubation à froid, favorisent la précipitation de l’ARN. L’ARN résultant capture l’expression génique induite par l’hôte, révélant la virulence bactérienne et les stratégies d’adaptation.

Protocole

1. Extraction des acides nucléiques

REMARQUE : Effectuez toutes les manipulations avec des solutions de phénol et de chloroforme dans une hotte à fumée.

1. Préparez un mélange 1:1 de phénol acidifié : chloroforme, 400 μl par échantillon. Mélangez dans des tubes séparés, puis retirez la couche aqueuse résultante par aspiration. Ajoutez 40 μl de SDS à 10 %.
2. Décongelez les tubes contenant le filtre sur de la glace pour les garder au frais. À chaque tube contenant un filtre, ajoutez 650 μl de tampon acétate-EDTA (AE) (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, eau sans RNASE).
3. Effectuez les étapes suivantes aussi rapidement que possible.
   1. Faites un vortex vigoureux sur le tube contenant le filtre afin que celui-ci se déplace vers la périphérie du tube et que le tampon lave complètement le filtre. Gardez toujours le tube au froid en le reposant sur de la glace.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire de faire un vortex supplémentaire dans le tube inversé pour nettoyer complètement les bactéries du filtre.
   2. Répétez pour tous les tubes. Il peut être utile de faire tourner la suspension rapidement (1 minute à 120 x g) à la fin du processus.
4. Transférez le tampon contenant des bactéries dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant le mélange SDS et phénol/chloroforme. Répétez pour tous les tubes. Il peut être nécessaire de faire tourner à nouveau les tubes contenant le filtre (1 min à 120 x g) pour obtenir le tampon résiduel du filtre.
5. Placez tous les tubes de 1,5 ml dans un dispositif à vortex multi-tubes, puis utilisez le vortex à pleine vitesse pendant 10 minutes.
6. Incubez les tubes dans un bloc chauffant à 65 °C pendant 10 minutes. Centrifugez à la vitesse maximale (> 14 000 x g) pendant 5 minutes.
7. Transférez la couche aqueuse (environ 400 μl) de chaque tube vers un nouveau tube de 1,5 ml contenant 40 μl d’acésate de sodium 3 M (pH 5,2) et 1,0 ml d’éthanol à 100 %. Faites un vortex sur chaque tube soigneusement.
   REMARQUE : Le glycogène peut être ajouté à cette étape pour améliorer la visualisation du pellet précipité.
8. Incubez les échantillons à -80 °C pendant 1 heure. Sinon, incubez des échantillons à -20 °C pendant la nuit. Ensuite, centrifugez les échantillons à 4 °C pendant 20 minutes à vitesse maximale (> 14 000 x g).
9. Aspirez soigneusement l’éthanol (couche supérieure) de chaque tube. Ajoutez 500 μl d’éthanol froid à 70 % à chaque échantillon et formez un vortex minutieux. Centrifugeuse à 4 °C pendant 20 minutes à vitesse maximale (> 14 000 x g).
10. Aspirez soigneusement l’éthanol de chaque tube. Faites sécher les échantillons pendant environ 2 minutes à l’aide d’un évaporateur sous vide sans chauffage. Ne séchez pas trop les échantillons.
11. Ajoutez 25 μl d’eau sans RNase à chaque échantillon. Incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Prenez soin de vortex et de spin-down.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Listeria monocytogenes 10403S
H2 O, sans ARNSE	Thermo Scientific	10977-015	L’eau traitée par DEPC peut être utilisée
pH saturé en phénol 4,3	Fisher	BP1751I-400
Chloroforme	Fisher	BP1145-1
Alcool iso-amyl	Sigma-Aldrich	W205702
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10 %	Sigma-Aldrich	L4522
Absolu de l’éthanol	Merck Millipore	1070174000
Filtres MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Génie 2	Industries scientifiques	Modèle G560E
Bloc chauffant à 65 °C	Thermo Scientific
Centrifugeuse table à 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipettes stériles, 25 ml	Greiner
Tubes Falcon, 50 ml	Greiner
Tubes de 1,7 ml, sans RNase	Axygène	MCT-175-C
Système SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA